Разработана методика определения β-лактоглобулина (БЛГ) в молоке и молочных продуктах с применением метода иммуноферментного анализа (ИФА). Контроль содержания β-лактоглобулина (БЛГ) осуществляют в молоке и молочных продуктах, включая продукты с пониженной аллергенностью, получаемые путем ферментативного гидролиза молочного белка. Изучены концентрационные и кинетические характеристики взаимодействий в системе иммуноанализа, определен оптимальный режим проведения иммунодетекции. Показано, что оптимальные аналитические характеристики ИФА обеспечиваются при иммобилизации в лунках планшета БЛГ в концентрации 5 нг/мл и использовании антител против БЛГ в концентрации 0,2 мкг/мл. Сокращение продолжительности конкурентной стадии в два раза, с обычного часа до 30 минут, не приводит к потере ни чувствительности, ни амплитуды детектируемого сигнала. Предлагаемая методика позволяет проводить все стадии анализа при комнатной температуре. Рабочий диапазон определяемых концентраций составляет от 0,03 до 2,5 мкг/мл. Коэффициент вариации в рабочем диапазоне составляет от 1,8 % до 9,2 %, а в экспериментах по воспроизводимости измерений в течение недели – не более 10,5 %.
Method for determination of beta-lactoglobulin (BLG) in milk and milk products by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been developed. This method is used for the content control of beta-lactoglobulin in milk and milk products, including products with reduced allergenicity, obtained by enzymatic hydrolysis of milk protein. Concentration and kinetic characteristics of the interactions in the immunoassay system were studied and the optimal mode of immunodetection has been determined. It is shown that the optimal analytical parameters are provided when BLG is immobilized in ELISA microplate wells from a concentration of 5 ng/ml and the antibodies against BLG are used in a concentration of 0.2 ug/ml. Shortening competitive step twice (from conventional 1 h to 30 min) does not lead to loss neither sensitivity nor amplitude of the detected signal. The proposed method allows to carry out all stages of the analysis at room temperature. Working range of the measured BLG concentration is from 0.03 to 2.5 ug/ml. The coefficient of variation in the working range is from 1.8 % to 9.2 %; the reproducibility of measurements in the course of a week – not more than 10.5 %.
1. Егоров А. М., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б., Гаврилова Е. М. Теория и практика иммуноферментного анализа – М.: Высш. шк., 1991. – 288 с.
2. Патент РФ на изобретение № 2375910, 03.06.2008.
3. Blanc F., Bernard H., Alessandri S. et al. Update on optimized purification and characterization of natural milk allergens // Mol. Nutr. Food Res. – 2008. Vol. 52. – P. 166–175.
4. Bonfatti V., Grigoletto L., Cecchinato A. et al. Validation of a new reversed-phase high-performance liquid chromatography method for separation and quantification of bovine milk protein genetic variants // J. Chromatogr. A. – 2008. Vol. 1195. – P. 101–106.
5. Fiocchi A., Brozek J., Schunemann H. et al. World Allergy Organization (WAO) diagnosis and rationale for action against cow’s milk allergy (DRACMA) guidelines // Pediatr. Allergy Immunol. – 2010. Suppl. 21. – P. 57–161.
6. Galvani M., Hamdan M., Righetti P.G. Two-dimensional gel electrophoresis/matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry of a milk powder // Rapid Commun. Mass Spectrom. – 2000. Vol. 14. – P. 1889–1897.
7. Picariello G., Ferrantia P., Fierro O. et al. Peptides surviving the simulated gastrointestinal digestion of milk proteins: Biological and toxicological implications // J. Chromatogr. B. – 2010. Vol. 878. – P. 295–308.
8. Restani P., Ballabio C., Di Lorenzo C. et al. Molecular aspects of milk allergens and their role in clinical events // Anal. Bioanal. Chem. – 2009. Vol. 395. – P. 47–56.
9. Strange E. D., Malin E. L., Van Hekken D. L., Basch J. J. Chromatographic and electrophoretic methods used for analysis of milk proteins // J. Chromatogr. – 1992. Vol. 624. – P. 81–102.
10. Wal J.M. Bovine milk allergenicity // Ann. Allergy Asthma Immunol. – 2004. Vol. 93. – P. 2–11.