Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,039

Сахарный диабет (СД) представляет группу гетерогенных заболеваний, в основе которых лежит повышение концентрации глюкозы в крови. СД – хроническое заболевание, связанное с нарушением, прежде всего, углеводного обмена веществ, что со временем приводит к серьезным поражениям сосудов сердца, почек, глаз и нервов [1; 2]. СД считается ведущей причиной сердечно-сосудистых заболеваний атеросклеротического характера, хронической почечной недостаточности, ретинопатии, приводящей к слепоте, макроангиопатии, заканчивающейся ампутацией сегментов нижних конечностей, повышением общей смертности населения и т.д. Причины смертей 1,6 миллиона людей в год напрямую связаны с СД [3].

В настоящее время для лечения СД используется гипербарическая оксигенация (ГБО). Гипербарическая терапия - это клиническое лечение, направленное на повышение уровня кислорода в крови и тканях. Использование ГБО для лечения инсулинозависимого СД влияет на изменение параметров окислительного стресса, молекулярных механизмов в крови больных. Многие исследования были посвящены изучению физиологических эффектов ГБО на функциональное состояние эндотелия, а также на изменения концентрации и действия физиологических медиаторов сосудистой функции, таких как оксид азота (NO) [4; 5], ацетилхолин [5], метаболиты арахидоновых кислот [6; 7], O2- (супероксидный анион радикал), H2O2 (перекись водорода) [8], но до сих пор нет ясного представления о механизмах действия ГБО на организм, в том числе и при СД. Это тем более представляет интерес, так как при определенных режимах гипербарическая терапия сопровождается повышением перекисного окисления липидов. В то же время СД сам по себе вызывает окислительный стресс [9], и продолжительное воздействие ГБО может усугубить этот стресс, тем самым ускорить прогрессирование заболевания. Однако комплексных исследований, оценивающих такие токсические эффекты при СД, в доступной нам литературе нами не было найдено.

Целью данного исследования является изучение влияния гипербарической оксигенации при лечении инсулинозависимого СД на параметры окислительного стресса в организме крыс.

Материалы и методы исследования

Соблюдение этических стандартов. Все экспериментальные исследовательские работы проведены в строгом соответствии с Директивой Европейского союза по охране лабораторных животных (№ 2010/63/EU) и одобрены Комитетом по этике факультета медицинских наук Университета Крагуеваца, Сербия.

В работе использовались крысы Вистар (самцы), альбиносы (в возрасте 10 недель, средний вес 200 ± 20 г), которые содержались в виварии с регулируемой температурой (22 ± 2°С), с 12-часовым чередованием светового и темного циклов. Животные были обеспечены стандартным кормом и водой. Перед взятием пробы крови животных анестезировали комбинацией кетамина и ксилазина и выводили из эксперимента путем декапитации с помощью гильотины для мелких лабораторных животных.

Моделирование сахарного диабета 1-го типа

В течение 24 часов крыс не кормили и внутрибрюшинно вводили им стрептозотоцин (СТЗ, 60 мг/кг массы тела, растворенный в 0,01 M буфере цитрата натрия, pH=4,5) для индукции диабета. Диагностику СД проводили, контролируя уровень глюкозы в крови в хвостовых венах с помощью портативного глюкометра. У животных, использованных в качестве модели, СД развивался, когда уровень глюкозы в их крови превышал 11,1 ммоль/л.

Протокол лечения человеческим инсулином НПХ

Гликемический контроль у крыс с СД осуществлялся путем подкожных инъекций экзогенного инсулина НПХ (нейтрального протамина Хагедрона, или изофанового инсулина) человека (ДНК-рекомбинантный инсулин человека пролонгированного действия). Целью инсулинотерапии было поддержание гликемии этих животных как можно ближе к нормогликемии (от 60 до 150 мг/дл) в течение 24 часов. Первоначально было выбрано введение 5 ЕД/сут. инсулина НПХ. В процессе лечения суточную дозу инсулина корректировали в среднем каждые 3 дня в зависимости от гликемии каждого животного (от 3 до 5 ЕД/сут.).

Гипербарическая оксигенация

Гипербарическую оксигенацию проводили в специальной оксигенационной камере для мелких экспериментальных животных, в которой крысы подвергались воздействию ГБО один раз в сутки. Протокол ГБО заключался в воздействии на организм экспериментальных животных 100% кислородом при давлении в 2,8 атм продолжительностью сеанса 1 час 5 дней в неделю на протяжении 2 недель терапии.

Экспериментальные группы:

1-я группа (контрольная) – СД, индуцированный инъекцией стрептозотоцина (СТЗ) (n=6);

2-я группа – СД+ИНС (получала инсулин НПХ 3-5 ЕД/сут.) (n=6);

3-я группа – СД+ИНС+ГБО (получала инсулин НПХ 3-5 ЕД/сут. + ГБО) (n=6);

4-я группа – СД+ГБО (получала ГБО) (n=6).

Подготовка образцов крови

После декапитации крыс образец цельной крови собирали в пробирки с 3,8% натрия цитратом. Образец крови перемешивали, чтобы тщательно смешать цитрат натрия с кровью. Затем образец трижды центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 10 мин. при комнатной температуре и растворяли в дистиллированной воде для приготовления гемолизата.

Спектрофотометрическое определение биомаркеров окислительного стресса

Из образцов плазмы крови определяли следующие биомаркеры окислительного стресса: супероксидный анион-радикал (O2-), пероксид водорода (H2O2), малоновый диальдегид (МДА) (методом TBARS – Thiobarbituricacidreactivesubstances), измеряемый как РСТК (реактивные соединения тиобарбитуровой кислоты). Все перечисленные биохимические параметры определяли спектрофотометрически (спектрофотометр Shimadzu UV-1800UV-VIS, Япония).

Определение супероксидного анион-радикала (O2-)

Определение количества супероксидного анион-радикала основано на реакции этих свободных радикалов с нитро-тетразолиевым синим – NBT (NitroBlueTetrazolium), в результате чего образуется нитроформазный синий. Для определения O2- в 50 мкл образца добавляли ex tempore 950 мкл эссенциальной смеси. Поглощение измеряли на длине волны 550 Нм три раза и каждые 60 секунд после смешивания.

Определение перекиси водорода (H2O2)

Определение количества перекиси водорода основано на реакции фенола красного с перекисью водорода, эта реакция катализируется ферментом пероксидазы из конской редьки HRPO (HorseRadishPerOxidase). Перекись водорода окисляет фенол красный, в результате чего образуется соединение, пик поглощения которого при λmax=610 Нм. Для определения перекиси водорода в образце помещали 200 мкл образца, в который добавляли 800 мкл раствора фенола красного и 10 мкл пероксидазы (POD). При добавлении фермента смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут с последующим измерением поглощающей способности на указанной длине волны.

Определение содержания малонового диальдегида (МДА) (методом TBARS)

Индекс перекисного окисления липидов определяется косвенно через продукт реакции перекисного окисления липидов тиобарбитуровой кислотой – TBARS (ThiobarbituricAcidReactiveSubstances). Для целей нашего исследования уровень TBARS в образце определяли спектрофотометрически. Для определения TBARS в образце использовали 0,8 мл образца и 0,2 мл 1% тиобарбитуровой кислоты, растворенной в NaOH. После добавления тиобарбитуровой кислоты смесь инкубировали в течение 15 минут при температуре 100°С, а затем при комнатной температуре в течение 10 минут. Уровни TBARS определяли на длине волны λ = 530 Нм.

Определение оксида азота (NO2-)

Уровень нитритов измерялся для того, чтобы косвенно оценить уровень оксида азота. Нитриты определяли количественно по методу Грина с использованием реактива Грисса. Образец осаждали 30% сульфосалициловой кислотой, перемешивали в течение 30 мин. и центрифугировали при 3000g. Равные объемы надосадочной жидкости и реактива Грисса, содержащего 1% сульфанил-амида в 5% растворе фосфорной кислоты, 0,1% нафталин-этилендиамин-дигидрохлорида, добавляли и инкубировали в течение 10 мин. в темноте и измеряли при длине 543 нм.

Определение восстановленного глутатиона (GSH)

Определение антиоксидантного защитного фермента – активность восстановленного глутатиона измеряли в лизате эритроцитов спектрофотометрическим методом. Этот метод основан на реакции окисления глутатиона 5, 5-дитио-бис-6, 2-нитробензойной кислотой методом Beutler. Для определения концентрации восстановленного глутатиона в 50 мкл лизированных эритроцитов добавляется 200 мкл 0,1% этилендиаминтетраацетата и 385 мкл осадочного буфера. Полученную таким образом смесь инкубируют в течение 15 минут на льду, после чего в течение 10 минут центрифугируют при 4000 об./мин. После центрифугирования отбирается 300 мкл супернатанта, в который добавляется 750 мкл дифосфата натрия и 100 мкл 5,5-дитиобиса-6,2-нитробензойной кислоты. Полученную таким образом смесь инкубируют в течение 10 минут, после чего измеряется поглощение образца на длине волны 412 Нм. Процедура подготовки слепого зонда такая же, как и для образцов, при этом вместо лизата эритроцитов используется тот же объем дистиллированной воды. Чтобы определить концентрацию GSH в образцах, была построена калибровочная кривая с использованием четырех стандартов с известными концентрациями глутатиона.

Определение каталазы (CAT)

Определение антиоксидантного фермента – активности каталазы (CAT) проводилось по методу Аэби. Для определения CAT использовали буфер, приготовленный образец лизата и 10 мМ H2O2. Активность CAT измеряли спектрофотометрически при длине волны 360 нм и выражали в Ед/мл/Hb гемолизата.

Определение супероксиддисмутазы (СОД)

Определение антиоксидантного фермента – активности супероксиддисмутазы (СОД) оценивали с помощью эпинефринового метода согласно Beutler. Образец гомогената ткани сердца сначала смешивали с карбонатным буфером, а затем в смесь добавляли эпинефрин. Активность СОД измеряли при длине волны 470 нм и выражали в Ед/мл/Hb гемолизата.

Аналитический статистический анализ выполнен с использованием Kruskal-Wallis и Tukey’s post-hoc test для сравнения изменений в процентах между группами. Статистическая значимость была установлена на уровне 0,05. Статистический анализ проводился с использованием IBMSPSS, версия 26.0.

Результаты исследования и их обсуждение

Исследование динамики изменения биомаркеров окислительного стресса – активности супероксидного анион-радикала (О2-) показало, что лечение крыс с СД 2-й группы инсулином увеличило уровень активности биомаркера на +5,7% по сравнению с 1-й группой (без лечения). В 3-й группе, где использовался инсулин и ГБО, уровень активности биомаркера снизился на 6,3%. В 4-й группе, при коррекции СД только гипербарической оксигенацией, уровень активности биомаркера достоверно снизился на 14,7% по сравнению с 1-й группой (табл. 1).

Таблица 1

Содержание супероксидного анион-радикала (О2-), перекиси водорода (Н2О2), малонового диальдегида (МДА) и оксида азота (NO2) у крыс с сахарным диабетом без лечения и после лечения инсулином, инсулином в комбинации с ГБО и только ГБО

Примечание: СД – сахарный диабет, ИНС – инсулинотерапия, ГБО – гипербарическая оксигенация; * – p < 0,05 в сравнении с контрольной 1-й группой, # – p < 0,05 в сравнении со 2-й группой лечения инсулином.

Исследование динамики изменения биомаркеров окислительного стресса – активности перекиси водорода (Н2О2) показало, что лечение СД инсулином во 2-й группе увеличило уровень активности биомаркера на 26,7% по сравнению с 1-й группой (без лечения). В 3-й группе, где использовался инсулин и ГБО, уровень активности биомаркера увеличился на 1,1%. В 4-й группе, при коррекции СД только гипербарической оксигенацией, уровень активности биомаркера достоверно снизился на 5,3% по сравнению с 1-й группой (табл. 1).

Дальнейшее исследование изменения биомаркеров окислительного стресса – уровня малонового диальдегида (по методу TBARS) показало, что лечение СД инсулином во 2-й группе статистически значимо увеличило уровень активности биомаркера на 35,7% по сравнению с 1-й группой (без лечения). В 3-й группе, где использовался инсулин и ГБО, уровень активности биомаркера уменьшился на 9,4%. В 4-й группе при коррекции СД только гипербарической оксигенацией уровень активности биомаркера увеличился на 1,1% по сравнению с 1-й группой (табл. 1).

Динамика изменений активности оксида азота (NO2-) показала, что лечение СД инсулином во 2-й группе статистически значимо снижает уровень оксида азота на 54,6% по сравнению с 1-й группой (без лечения). В 3-й группе, где использовался инсулин и ГБО, уровень активности снизился на 8,2%. В 4-й группе при коррекции СД только гипербарической оксигенацией уровень активности оксида азота снизился на 4,3% по сравнению с 1-й группой (табл. 1).

Изменения активности антиоксидантного фермента – супероксиддисмутазы (СОД) показали, что лечение СД инсулином во 2-й группе повысило уровень фермента на 12,2% по сравнению с 1-й группой (без лечения). В 3-й группе, где использовался инсулин и ГБО, уровень активности фермента статистически значимо повысился на 50,2%. В 4-й группе при коррекции СД только гипербарической оксигенацией уровень активности фермента достоверно повысился на +61,2% по сравнению с 1-й группой (табл. 2).

Таблица 2

Активность супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (CAT) и восстановленного глутатиона (GSH) у крыс с сахарным диабетом без лечения и после лечения инсулином, инсулином в комбинации с ГБО и только ГБО

Примечание: СД – сахарный диабет, ИНС – инсулинотерапия, ГБО – гипербарическая оксигенация; * – p < 0,05 в сравнении с контрольной 1-й группой, # – p < 0,05 в сравнении со 2-й группой лечения инсулином.

Динамика изменения активности антиоксидантного фермента – каталазы (САТ) показала, что лечение СД инсулином во 2-й группе повысило уровень фермента на 22,2% по сравнению с 1-й группой (без лечения). В 3-й группе, где использовался инсулин и ГБО, уровень активности фермента статистически значимо повысился на 108,3%. В 4-й группе при коррекции СД только гипербарической оксигенацией уровень активности фермента достоверно повысился на 115,2% по сравнению с 1-й группой (табл. 2).

Дальнейшее исследование динамики изменений активности антиоксидантных ферментов – восстановленного глутатиона (GSH) показало, что лечение СД инсулином во 2-й группе повысило уровень фермента на 9,6% по сравнению с 1-й группой (без лечения). В 3-й группе, где использовался инсулин и ГБО, уровень активности фермента статистически значимо повысился на 84,2%. В 4-й группе при коррекции СД только гипербарической оксигенацией уровень активности фермента снизился на 14,4% по сравнению с 1-й группой (табл. 2).

Полученные результаты выявили, что монотерапия инсулином экспериментальных крыс с инсулинозависимым сахарным диабетом сопровождается увеличением содержания как прооксидантов, так и антиоксидантов. Подобный эффект от моноинсулинотерапии отмечается и у пациентов с сахарным диабетом I типа, однако четких объяснений этому явлению до сих пор не существует [10; 11]. Количественные изменения биомаркеров окислительного стресса показали, что уровни супероксидного анион-радикала (O2-), пероксида водорода (H2O2), малонового диальдегида (TBARS), оксида азота (NO2-) в группах лечения 2, 3, 4 имеют тенденцию к снижению в сравнении с 1-й группой животных с сахарным диабетом. Наиболее заметное статистически значимое снижение наблюдалось в 3-й и 4-й группах, где лечение проводилось СД+ИНС+ГБО и СД+ГБО, соответственно. ГБО способствует восстановлению исходной активности ПОЛ за счёт изменения уровней изучаемых прооксидантов (в основном за счёт снижения) и повышения уровней антиоксидантов (за счет их повышения), что согласуется с данными профессиональной литературы [12; 13]. Монотерапия ГБО снижает содержание супероксидного анион-радикала (O2-) и пероксида водорода (H2O2), не влияет на уровень малонового диальдегида и снижает уровень диоксида азота, при этом наблюдается активация супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (САТ) при сохранении уровня восстановленного глутатиона.

Таким образом, выявлено, что монотерапия ГБО снижает уровень биомаркеров окислительного стресса крови у крыс с сахарным диабетом 1 типа, то есть обладает антиоксидантным эффектом.

Исследования динамики антиоксидантных ферментов окислительного стресса показали, что активности супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (САТ) и содержание восстановленного глутатиона (GSH) в группах лечения 2, 3 и 4 имеют тенденцию к увеличению в сравнении с 1-й группой животных с сахарным диабетом. Полученные результаты согласуются с данными, приведенными в работах [4; 14; 15], где ГБО активирует экспрессию генов антиоксидантов в эндотелиальных клетках человека, защищая ишемизированную ткань от окислительного повреждения. В наших исследованиях наиболее заметное статистически значимое увеличение активности антиоксидантов наблюдалось в 3-й и 4-й группах, где лечение проводилось СД+ИНС+ГБО и СД+ГБО, соответственно. Выявлено, что ГБО как с инсулином, так и отдельно повышает активность антиоксидантных ферментов крови у крыс с сахарным диабетом, то есть обладает антиоксидантным эффектом.

Выводы. В опытах на крысах с экспериментальной моделью инсулинозависимого сахарного диабета I типа показано, что гипербарическая оксигенация, использованная при лечении животных, влияет на параметры окислительного стресса и оказывает антиоксидантный эффект.

Комбинированное лечение с помощью ГБО и инсулинотерапии смоделированного инсулинозависимого сахарного диабета сопровождается снижением интенсивности свободнорадикального перекисного окисления липидов и нитрозилирующего стресса и выраженным антиоксидантным эффектом на всех уровнях его развития. Монотерапия ГБО инсулинозависимого сахарного диабета обладает наиболее выраженным эффектом инактивации кислородной инициации свободнорадикальных процессов и способствует значительному восстановлению сопряженности действия антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы и каталазы, предотвращая образование и накопление нерастворимых цитотоксичных продуктов.

Таким образом, проведение ГБО больным с сахарным диабетом I типа может быть рекомендовано в качестве обязательного компонента лечения данной патологии.