Ранее на кафедре фармакологии Казанского ГМУ были изучены препараты класса фосфорилацетогидразидов, обладающие широким спектром психотропной активности; детально исследованы препараты «КАПАХ» и «Фосфабензид», разработаны методики контроля их качества [4,5].
Продолжением исследований биологической активности фосфорилацетогидразидов стало изучение нового биологически активного вещества - натриевой соли ацетилгидразино-4-хлорфенилфосфиновой кислоты (Na-CPAH), синтезированного на кафедре органической химии Казанского НИТУ.
Фармакологами КазГМУ установлена низкая токсичность, высокая антидепрессивная и мнемотропная активность Na-CPAH, превосходящая активности препаратов «КАПАХ» и «Фосфабензид» [3].
Для введения в медицинскую практику нового БАВ, кроме параметров эффективность и безопасность, необходимо также разработать надежные методики контроля качества. В современном фармацевтическом анализе органических лекарственных веществ широко применяются физико-химические методы, такие как УФ-, ИК-спектроскопия, позволяющие проводить идентификацию лекарственных веществ, оценивать чистоту и количественное содержание по фармакологически активной части молекулы [1].
Цель настоящего исследования - разработать оптимальные методики качественного и количественного определения БАВ Na-CPAH.
Материалы и методы. В качестве объекта исследования использовалось БАВ Na-CPAH. По внешнему виду это аморфный порошок кремового цвета, без запаха и вкуса; легко растворим в воде, практически не растворим в эфире, хлороформе и спирте.
Подлинность вещества Na-CPAH устанавливали физико-химическими методами: ИК - и УФ-спектрофотометрией, рекомендованными ГФ XII.
ИК-спектры снимали в таблетках калия бромида на ИК-спектрометре фирмы "Bruker" VECTOR 22 (рис. 1).
УФ-спектры поглощения снимали на двухлучевом регистрирующем спектрофотометре Lambda 25 («Perkin Elmer», США) с использованием сервисного пакета программ «Perkin Elmer UV WinLab 5.2.0.0646 / Lambda 25 1.27»."
Помимо физико-химических методов изучены окислительно-восстановительные реакции Na-CPAH по гидразидной группе. В качестве редокс-реактивов на Na-CPAH нами исследованы растворы йода, калия перманганата и серебра нитрата. Для объективной оценки, исследования проводились параллельно с испытуемым и контрольным растворами. Определение чувствительности реакций обнаружения Na-CPAH проводили визуально и выражали в мкг/мл вещества в пробе.
Количественное содержание Na-CPAH в субстанции определяли методом прямой УФ-спектрофотометрии на регистрирующем спектрофотометре Lambda 25 («Perkin Elmer», США).
Статистическая обработка результатов количественного определения проводилась по методике, рекомендованной ГФ XI [2] .
Результаты исследования и их обсуждения. ИК-спектр Na-CPAH (рис.1) имеет характеристические полосы поглощения следующих групп: фосфорильная Р=О (1191 см -1), карбонильная С=О (1642 ,1454см-1 ), гидразидная NHNH2 (3392 см-1 ).
Рис. 1. ИК-спектр Na-CPAH
УФ-спектр поглощения 0,02 % раствора субстанции в области от 250 до 300 нм имеет максимумы поглощения при 263,270 и 275 нм, что объясняется электронными переходами в ароматических кольцах (рис. 2).
Рис. 2. УФ-спектр водного раствора Na-CPAH
Качественные реакции (на гидразидную группу) показали, что исследуемое БАВ обесцвечивает раствор йода, перманганата калия в кислой среде, а с аммиачным раствором нитрата серебра при нагревании образует серый осадок серебра в виде серебряного зеркала.
Реакция с перманганатом калия, как наиболее чувствительная, рекомендована нами в качестве реакции подлинности.
Методика: К 0,02 г субстанции прибавляют 1 мл воды и 0,25 мл хлористоводородной кислоты разведенной 8,3 %. При прибавлении нескольких капель 0,1 % раствора перманганата калия происходит обесцвечивание раствора.
Чувствительность реакции 50 мкг/мл
Для количественного анализа был выбран максимум поглощения при длине волны 263±2 нм (рис. 2). Изучение зависимости между оптической плотностью и концентрацией раствора Na-CPAH показало, что она имеет линейный характер, значение оптической плотности укладываются в интервал 0,2 - 0,8 мг/мл (табл.1), значение коэффициента корреляции составляет 0,9947, что позволяет использовать данный градуировочный график для количественного определения Na-CPAH (рис. 2).
Таблица 1. Определение удельного показателя поглощения водных растворов Na-CPAH
|
С, % |
Aср. |
|
Метрологические Характеристики |
|
0,01 |
0,18103 |
18,1 |
f=6
S2=1,05 S=1,025
S R=2,05 Q(95%,7)=0,51 ε=±1,14 % |
|
0,015 |
0,2687 |
17,91 |
|
|
0,02 |
0,36134 |
18,06 |
|
|
0,025 |
0,4791 |
19,16 |
|
|
0,03 |
0,6021 |
20,07 |
|
|
0,035 |
0,7003 |
20,01 |
|
|
0,04 |
0,80622 |
20,15
|
=19,06
На основе полученных результатов рассчитывали значения удельного показателя поглощения Na-CPAH (табл. 1). Рассчитанный удельный показатель поглощения водных растворов Na-CPAH при длине волны 263±1 нм равен 19,07
Рис. 3. Определение подчиненности раствора Na-CPAH в водных растворах основному закону светопоглощения
Количественное определение Na-CPAH проводили с помощью калибровочного графика, удельного показателя поглощения и сравнением оптических плотностей стандартного и анализируемого растворов.
В качестве стандарта использовали 0,02 % водный раствор Na-CPAH с известным содержанием основного вещества. Оценку чистоты Na-CPAH и идентификацию образующихся при его синтезе побочных продуктов проводили методом тонкослойной хроматографии с использованием стандартных пластинок «Sorbfil- UV-254».
Для объективной оценки исследования проводились параллельно с испытуемым и контрольным растворами.
Количественное определение. Методика:
Испытуемый раствор. Около 0,02 г субстанции (точная навеска), помещают в мерную колбу объемом 100 мл, растворяют в воде очищенной, доводят объем раствора тем же растворителем до метки.
Стандартный раствор. Около 0,02 г субстанции (точная навеска) стандартного образца Na-CPAH, помещают в мерную колбу объемом 100 мл, растворяют в воде очищенной, доводят объем раствора тем же растворителем до метки.
Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора и стандартного раствора на спектрофотометре в максимуме поглощения при 263 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Таблица 2. Результаты количественного определения Na-CPAH методом УФ-спектрофотометрии
|
№ п/п |
Взято, г |
Найдено, % |
||
|
По удельному показателю поглощения |
По раствору стандартного образца |
По калибровочной кривой |
||
|
1. |
0,0185 |
99,16 |
99,08 |
99,36 |
|
2. |
0,0190 |
99,23 |
99,21 |
99,21 |
|
3. |
0,0195 |
99,12 |
99,68 |
98,73 |
|
4. |
0,02 |
99,43 |
99,39 |
98,9 |
|
5 |
0,0205 |
99,36 |
99,18 |
99,4 |
|
ε |
±0,7% |
±0,74% |
±0,92% |
|
Согласно полученным данным с равной эффективностью можно использовать все методы расчета концентрации исследуемого вещества. Относительная погрешность определения составляет ± 0,92 %.
При оценке воспроизводимости результатов количественного содержания Na-CPAH методом УФ-спектрофотометрии на основе разработанной нами методики установлено, что выборка признана однородной и не отягощенной грубой ошибкой. Метрологические характеристики представлены в таблице 3.
Таким образом, разработаны методики идентификации нового БАВ с выраженной нейротропной активностью Na-CPAH с применением качественных и количественных методов анализа. Установлена возможность применения метода УФ-спектрофотометрии для количественной оценки субстанции Na-CPAH и разработана методика.
Таблица 3. Данные статистической обработки полученных результатов
|
N |
f |
|
S2 |
S |
S |
R |
Q(P,n) |
ε |
|
5 |
4 |
99,26 |
0,02 |
0,14 |
0,06 |
0,2 |
Q(95%,5)=0,64 |
±0,4% |
|
5 |
4 |
99,3 |
0,05 |
0,23 |
0,1 |
0,1 |
Q(95%,5)=0,64 |
±0,64% |
|
5 |
4 |
99,08 |
0,06 |
0,26 |
0,1 |
0,24 |
Q(95%,5)=0,64 |
±0,72% |
Выводы
- Изучены физико-химические свойства нового БАВ Na-CPAH с нейротропной активностью, на основе которых установлена его подлинность (УФ-, ИК-спектры, цветные реакции с перманганатом калия).
- Разработана методика количественного определения Na-CPAH методом УФ-спектрофотометрии.
Рецензенты:
Егорова С. Н., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой ФПК и ППС ГБОУ ВПО «КазГМУ», г. Казань.
Камаева С. С., д.м.н., доцент кафедры технологии лекарств ГБОУ ВПО «КазГМУ», г. Казань.
Библиографическая ссылка
Макарова Е.А., Сидуллина С.А., Семина И.И., Тарасова Р.И., Мустафин Р.И. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА NA-CPAH, ОБЛАДАЮЩЕГО НЕЙРОТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 5. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=7330 (дата обращения: 20.04.2024).