Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,682

ИЗОЛИРОВАНИЕ, ОБНАРУЖЕНИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗОЛПИДЕМА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

Хомов Ю.А. 1 Крылова Е.А. 1 Егорова Е.И. 1
1 ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития РФ
В результате проведенных исследований, после теоретического прогнозирования и экспериментального подтверждения, определены оптимальные условия экстрагирования золпидема из биологических жидкостей (кровь, моча) с учетом рН, рКа, природы органического растворителя. Разработаны способы детектирования и количественного определения золпидема в извлечениях из биологических жидкостей различными физико-химическими методами: тонкослойной хроматографией (ТСХ), высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), ультрафиолетовой спектрометрией (УФ-) и газовой хроматографией – масс-спектрометрией (ГХ/МС). Приводятся условия исследования. Результаты охарактеризованы пределами обнаружения и определения золпидема при различных видах анализа. Золпидем укладывается в условия ТСХ скрининга лекарственных соединений, имеющих токсикологическое значение. Методики сведены в логическую схему анализа биологических жидкостей при диагностике интоксикаций золпидемом. Аналитическая информация, которая может быть получена с помощью данных методик, позволяет уточнить клинический диагноз и обеспечивает надежную идентификацию золпидема при клинико-диагностических (КДА) и химико-токсикологических (ХТА) анализах.
ГХ/МС – спектрометрия
УФ-
ВЭЖХ
ТСХ
экстракция
биологические жидкости
золпидем
1. Борисова, Е. О. Золпидем - современный эффективный препарат для лечения бессонницы / Е. О. Борисова // Фарматека. - 2001. - №3. - С. 40-42.
2. Золпидем и зопиклон: развитие зависимости // Безопасность лекарств. - 2000. - №1. - 17 с.
3. Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. - 2010. - 18-е изд. - М.,2010. - С. 331-334.
4. Сиволап, Ю. П. Фармакотерапия в наркологии (краткое справочное руководство) / Ю. П. Сиволап, В. А. Савченков. - М.: Медицина, 2000. - С. 106-108.
5. Шмыров, В. И. Открытое многоцентровое исследование золпидема (ивадала) при лечении инсомнии / В. И. Шмыров, Л. Б. Клочкова // Фарматека. - 2001. - №5. - С. 32-43.
6. Baselt, R. Disposition of toxic drugs and chemicals in man, 5-th ed. California: Chemical Toxicology Institute Foster City. - 2000. - P. 896.
7. Levine, B. Zolpidem distribution in postmortem cases / B. Levine, S. C. Wu, J. E. Smialek // J. Forensic Sci. - 1999. - Vol. 44. - №2. - P. 369-371.
Проблема нарушений сна (инсомния) продолжает сохранять своё медицинское и социальное значение. Поэтому снотворные средства (гипнотики) и способы лечения инсомний являются предметом постоянного внимания специалистов и врачей.

Основным вопросом лечения инсомний в настоящее время является не столько недостаточная эффективность применяемых лекарственных средств, сколько недостаточная безопасность лечения этими препаратами [1]. Одним из главных представителей нового класса является золпидем, который широко и эффективно используется в медицинской практике за рубежом, а в последние годы и в России [3, 5].

Однако в связи с нежелательными побочными явлениями со стороны центральной нервной системы (спутанность сознания, эйфория и др.) может быть использовано в немедицинских целях. Немедицинское применение препарата и значительное превышение рекомендованных доз золпидема способно вызывать лекарственный делирий. Несмотря на сравнительно невысокий наркогенный потенциал [4], может вызывать пристрастия и присутствует в сфере незаконного оборота психоактивных веществ. При одновременном применении с препаратами, действующими на ЦНС, алкоголем, наблюдается взаимное усиление действия, что является причиной интоксикаций различной степени тяжести и даже отравлений [2, 7].

Для своевременной и объективной диагностики интоксикаций золпидемом, учитывая нехарактерность клинической картины, особое значение приобретают результаты химического анализа биологических жидкостей (моча, кровь).

Целью исследования явилась разработка и оптимизация методик экстракции, идентификации и количественного определения золпидема для его клинико-диагностических и химико-токсикологических анализов.

На первом этапе предварительного скрининга установлено, что из реакций с осадительными реактивами наиболее чувствительной является взаимодействие с реактивом Драгендорфа (0,57 мкг вещества в пробе). При изучении реакций окрашивания наиболее чувствительной является реакция с реактивом Марки (10 мкг в пробе). Обе реакции использованы для обнаружения зон локализации золпидема при ТСХ.

Далее исследована возможность идентификации золпидема методом ТСХ на пластинах Merck в индивидуальных растворителях и различных комбинированных системах растворителей, применяемых при ХТА лекарственных веществ в условиях аналитического скрининга. Для детектирования зон локализации золпидема на хроматограммах использовали:

  • визуальное наблюдение пластинки в фильтрованном УФ-свете при λ=254 (темно-фиолетовые пятна, предел обнаружения 0,30 мкг) и при 365 нм (свечение, проявляющееся в виде сиреневой флуоресценции, предел обнаружения 0,18 мкг);
  • обработку реактивом общегруппового назначения Драгендорфа в модификации по Молдаверу (коричневато-оранжевые пятна, предел обнаружения 0,35 мкг);
  • обработку более специфическими реагентами: реактив Марки капельно (красно-оранжевое окрашивание, предел обнаружения 7,0 мкг).

Установлено, что в исследованных 11 индивидуальных растворителях (метанол, этанол, ацетон, хлороформ и др.) золпидем не обладает достаточной хроматографической подвижностью, оставаясь в основном вблизи стартовой линии.

При исследовании же в комбинированных системах растворителей хроматографическая подвижность золпидема проявляется в интервале Rf от 0,38 до 0,77, при значении 0,64 в общей универсальной скрининговой системе: толуол - ацетон - этанол - 25 %  раствор аммиака, 45:45:7,5:2,5;  и скрининговой для азотсодержащих соединений основного характера системе: диоксан - хлороформ - ацетон - 25 % раствор аммиака,  47,5:45:5:2,5 (Rf 0,67), которые были избраны нами в качестве базовых для ХТА золпидема.

Была исследована возможность доказательства и определения золпидема методами УФ-, ГХ/МС-спектроскопии и ВЭЖХ.

Исследование золпидема методом хромато-масс-спектроскопии проведено на хроматографе Agilent 6850, газохроматографическая колонка HP-5MS. Для обнаружения использован масс-селективный детектор (МСД) фирмы Hewlett-Packard. Газ?носитель - гелий. Скорость расхода газа-носителя 1,5 мл/мин. Ввод пробы ручной, без деления потока газа-носителя. Объем пробы 1 мкл в этаноле. МСД работает в режиме электронного удара при 70 эВ.

Время удерживания золпидема 9,65 мин. Проведена регистрация масс-спектров в режиме полного сканирования от 40 до 450 аем. Характеристические ионы при выделении фрагментограммы с временем удерживания 9,65 мин. - 235, 307, 219, 92 m/z (данные приведены в порядке уменьшения интенсивности). При сравнении с масс-спектрами библиотек совпадение времени удерживания и масс-спектра составляло 98%.

Количественное ГХ/МС определение проводили в тех же условиях, применяя метод внутреннего стандарта (метиловый эфир налидиксовой кислоты). Предел обнаружения - 10 нг/мл, предел определения - 25 нг/мл.

УФ-спектрофотометрия проведена на приборе Specord 40 М.

Для определения золпидема как соединения, содержащего хромофорные группы, использован метод УФ-спектрофотометрии. УФ?спектры поглощения стандартного раствора золпидема с концентрацией 18 мкг/мл снимались в 1 см кюветах в интервале длин волн 220?400 нм относительно чистого растворителя. Анализ электронных спектров в различных растворителях показал, что золпидем имеет УФ-спектры в полярных растворителях (вода, метанол, 0,1М раствор хлористоводородной кислоты), характеризующиеся одной полосой поглощения с двумя максимумами и одним минимумом.

При наличии ярко выраженного максимума абсорбции золпидема в 0,1М растворе хлористоводородной кислоты при 295 нм разработана спектрофотометрическая методика его определения. Подчинение основному закону светопоглощения от 4 до 32 мкг/мл золпидема. Коэффициент корреляции 0,9996. Удельный показатель 480. Чувствительность определения 0,21 мкг/мл.

Метод ВЭЖХ применен для идентификации и количественного определения золпидема на основе приборного комплекса «Милихром А-02» с УФ?детектором, стальной хроматографической колонкой диаметром 2 мм, длиной 75 мм, заполненной обращенно-фазным сорбентом марки Силасорб 100?5С18, размер частиц 5 мкм. В качестве подвижной фазы избрана смесь ацетонитрил - вода 65:35 при рН 3 (добавлением фосфатного буфера). Скорость подачи элюента 75 мкл/мин. Объем вводимой пробы на анализ 5 мкл. УФ-спектр золпидема в подвижной фазе характеризуется одной полосой поглощения с тремя максимумами и двумя минимумами. Максимум при 240 нм избран в качестве аналитической длины волны. Идентификация золпидема строилась на определении абсолютного времени удерживания - 2,82±0,02 спектральных соотношений при 240/300 нм - 0,538. Расчетная чувствительность обнаружения золпидема - 31 нг/мл. Для количественного определения использовали метод абсолютной калибровки. Линейная зависимость площади хроматографического пика от концентрации золпидема в интервале 6,5-130 мкг/мл. Коэффициент корреляции при ВЭЖХ составил 0,9998.

Для решения вопроса максимального экстагирования соединения из объектов анализа учитывали показатель ионизации (рКа золпидема 6,2) [6].

Золпидем был включен в программу для ПК, которая позволила получить значения степени ионизации золпидема в процентах при рН 1-14. Установлено, что при рН 1-2 соединение полностью ионизировано. Начиная с рН 3, появляется его молекулярная форма, которая достигает 100 % при рН 10. Поэтому возможно, что при ХТА и КДА максимальная экстракция золпидема органическими растворителями из водных извлечений должна достигаться при рН 9-10. Степень ионизации золпидема при данных рН минимальна. Однако в связи с лабильностью исследуемого соединения в щелочной среде (наличие амидной группировки) следует предполагать как наиболее оптимальное значение рН среды 8.

Далее было проведено экспериментальное подтверждение предположений экстрагируемости золпидема различными органическими растворителями в зависимости от рН среды: хлороформ, метиленхлорид и эфир. Растворители, имеющие величину диэлектрической проницаемости большую, чем у хлороформа, не исследовались в связи с их значительной смешиваемостью с водой.

Золпидем экстрагируется органическими растворителями, достигая максимума экстракции хлороформом 99,50 %, метиленхлоридом 99,85 %, эфиром 98,43 % при рН 8.

Полученные результаты послужили основой для разработки методик определения золпидема в биожидкостях. Из крови и мочи изолирование сводилось к прямой дробной экстракции метиленхлоридом (или хлороформом) при рН 8.

При исследовании биологических жидкостей УФ?спектрофотометрическое определение проводилось в аликвоте 1/2 часть извлечения при затравке 0,25 мг на 15 мл мочи или 5 мл плазмы.

При исследовании биожидкостей методом ВЭЖХ определение проводили при затравке 0,1 мг на 2 мл мочи или плазмы.

Разработанные методики анализа биологических жидкостей сведены в логическую схему.

Рисунок 1. Схема ХТА золпидема в биологических жидкостях

Данные количественного определения золпидема в моче и плазме приведены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты количественного определения золпидема в моче и плазме

Добавлено золпидема, в мг

Найдено золпидема, в %

Метрологи­ческие характерис­тики

Добавлено золпидема, в мг

Найдено золпидема, в %

Метрологи­ческие характерис­тики

При УФ-спектрофотометрии

На 15 мл мочи

На 5 мл плазмы

0,25

89,92

x‾ = 94,11

S = 2,97

Sx‾  = 1,33

εα = 3,70

Е= ±3,93%

0,25

76,80

x‾ = 78,73

S = 2,60

Sx‾  = 1,16

εα = ±3,22

Е = ±4,09%

0,25

95,08

0,25

82,40

0,25

96,85

0,25

80,08

0,25

92,19

0,25

78,45

0,25

96,50

0,25

75,92

При ВЭЖХ-определении

На 2 мл мочи

На 2 мл плазмы

0,1

94,06

x‾ = 96,40

S = 2,97

Sx‾  = 1,33

εα = 3,70

Е = ± 3,84

0,1

74,87

 x‾= 76,39

S = 1,82

Sx‾  = 0,81

εα = 2,25

Е = ± 2,95

0,1

96,73

0,1

77,48

0,1

99,00

0,1

77,70

0,1

99,49

0,1

73,99

0,1

92,73

0,1

77,9

Как видно из таблицы 1 при статистической обработке данных, полученных в ходе количественного определения золпидема в модельных пробах мочи и плазмы методами УФ-спектрометрии и ВЭЖХ, отражается вполне удовлетворительная сходимость результатов.

Проведен анализ золпидема в образцах реальной мочи пациентов после приема однократных терапевтических доз методом ГХ/МС. К исследуемым пробам по 2 мл добавляли по 20 мкл раствора внутреннего стандарта (спиртовый раствор метилового эфира налидиксовой кислоты) и образцы подвергали ТФЭ на патронах AccuBond II EVIDEX. Элюировали смесью дихлорметан - пропанол - 25% раствор аммиака,  4:1:0,1. Элюат испаряли досуха в токе азота при 60 ?С. Остатки реконструировали 200 мкл этилацетата и анализировали ГХ/МС, вводя по 1 мкл в инжектор хроматографа. Получена хроматограмма с временем удерживания 9,65 мин. Проведена регистрация масс-спектров в режиме селективного ионного мониторинга по ионам m/z 235, 307, 219 (золпидем) и 188, 215, 246 (внутренний стандарт). Результаты ГХ/МС количественного определения золпидема, выделенного из реальной мочи, получены с использованием компьютерной программы ChemStationG1701DA. Количественная оценка соответствия найденного соединения истинному соответствует требованиям метода.

Определяемые концентрации золпидема в моче после перорального приема 10 мг находятся выше предела количественного определения, что демонстрирует высокую чувствительность использованной ГХ/МС методики и позволяет обнаруживать и количественно определять золпидем в реальной моче на стадии его элиминации при приеме однократной терапевтической дозы.

Выводы

  1. Описана процедура пробоподготовки биологических жидкостей (моча, плазма) для анализа в них золпидема, заключающаяся в жидкостно-жидкостной экстракции (УФ-спектрометрия и ВЭЖХ) и твердофазной экстракции (ГХ/МС).
  2. Базируясь на использовании методов ТСХ, ВЭЖХ, УФ и ГХ/МС спектрометрии определены основные характеристики идентификации золпидема, в результате чего становится возможным проведение достоверного и надежного анализа этого соединения в биологических жидкостях для целей химико-токсикологического и клинико-диагностического исследований.
  3. Показана применимость методики ГХ/МС анализа для определения золпидема в образцах реальной мочи после приема разовых терапевтических доз.

Рецензенты:

  • Михалев А. И., д. фарм. н., профессор, зав. кафедрой биологической химии, ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития, г. Пермь.
  • Ярыгина Т. И., д. фарм. н., профессор, профессор кафедры  фармацевтической химии очного факультета, ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития, г. Пермь.

Библиографическая ссылка

Хомов Ю.А., Крылова Е.А., Егорова Е.И. ИЗОЛИРОВАНИЕ, ОБНАРУЖЕНИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗОЛПИДЕМА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 2.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=5868 (дата обращения: 21.11.2018).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252