В настоящее время применение комбинированной противовирусной терапии (КПТ) препаратами интерферона альфа (ИФНα) и рибавирина позволяет добиться стойкого вирусологического ответа и обеспечить предупреждение неблагоприятных исходов у больных ХГС [2, 9]. Однако, у некоторых пациентов, проходящих курс комбинированной антивирусной терапии, регистрируется снижение количества и угнетение фагоцитарной активности нейтрофилов, что может приводить к развитию бактериальных осложнений со стороны различных органов и систем [4, 5].
Выраженная интерферон-рибавирининдуцированная нейтропения требует снижения дозы применяемых препаратов или же их полной отмены [1], между тем, наиболее важным условием достижения устойчивого вирусологического ответа является, как известно, сохранение терапевтической дозы КПТ на максимально высоком уровне [3]. Схемы, применяемые для лечения уже развившегося нейтропенического синдрома у больных ХГС, требуют существенных материальных затрат, что, в современных условиях, не рационально с позиций фармакоэкономики, поэтому разработка доступных методов, направленных на как можно раннее выявление и предупреждение развития нейтропении у данной категории лиц, представляется весьма актуальной.
К сожалению, механизм развития нейтропении, обусловленной КПТ, до настоящего момента окончательно не установлен. Как известно, существует два типа гибели клеток - некроз и апоптоз. Первый ассоциируется с нарушением целостности клеточной мембраны вследствие повреждения или формирования пор. Апоптоз характеризует более мягкий процесс и предполагает серию морфологических изменений, приводящих к клеточной гибели. В настоящее время общепризнано, что этот процесс занимает ключевые позиции в элиминации аутореактивных T-лимфоцитов, уничтожении опухолевых и вирусинфицированных клеток, в том числе и при HCV-инфекции [8].
Цель исследования: изучить у больных хроническим гепатитом С, получающих комбинированную противовирусную терапию, патогенетическую роль апоптоза нейтрофилов в развитии интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении и на основе полученных данных разработать новый способ ее прогноза.
Материал и методы исследования
Для изучения структурных изменений в нейтрофильных гранулоцитах, происходящих у больных ХГС под действием противовирусных препаратов, определялся апоптоз нейтрофилов in vivo методом кожного «окна». Метод оценки функционального состояния нейтрофилов в кожном «окне» был впервые предложен Rebuck J.W. at al. [10]. Метод заключается в том, что на скарифицированный участок кожи фиксируют предметное стекло на 24 часа, после снятия стекла его подвергают окраске по Романовскому - Гимзе, под световым микроскопом подсчитывают клетки и описывают их морфологические особенности, которые отражают состояние миелоидного ростка кроветворения и способность организма реагировать на изменяющиеся условия гомеостаза. При постановке теста учитываются такие изменения цитоплазмы нейтрофилов, как нарушение ее зернистости; образование, повреждение или распад псевдоподий, а также мелкая фрагментация и расплывчатость ядер.
Постановка теста кожного «окна» у больных ХГС осуществлялась нами следующим образом. У пациентов с участка кожи на ладонной поверхности правого и левого предплечий, предварительно обработанных 96 % этиловым спиртом, скарификатором снимали слой эпидермиса 0,5×0,5 см. до сосочкового слоя дермы без повреждения сосудов. В место скарификации правого предплечья вносили 0,3 мл. 0,9 % раствора хлорида натрия. Затем этот участок покрывался стерильным предметным стеклом, которое фиксировалось лейкопластырем. На другое предметное стекло наносили с помощью микропипетки 3-5 капель, т. н., индуктора апоптоза нейтрофилов (ИАН) и после его высыхания фиксировали на скарифицированном участке левого предплечья. В качестве ИАН использовались препараты, применяемые у больных ХГС в качестве КПТ: 80 мг (1/5 разовой дозы) Ребетола и 0,6млн. МЕ (1/5 суточной дозы) Альтевира, разведенные в 1,0 л 0,9 % раствора натрия хлорида. Такое соотношение компонентов ИАН подобрано с учетом фармакокинетики (абсолютная биодоступность, максимальная концентрация препарата в плазме, объем распределения) и терапевтических доз рибавирина и ИФНα [6]. Через 24 часа стекла снимали, высушивали, фиксировали и окрашивали. Полученные мазки-отпечатки микроскопировали в иммерсионной системе 1×450, подсчитывали % содержания нейтрофилов от общего числа клеток (200 клеток) и проводили сравнительную морфологическую оценку с подсчетом процента нейтрофилов, находящихся в апоптозе, в каждом "кожном окне".
Стандартность условий данного исследования обеспечивалась использованием точно дозированных порций крови, антикоагулянта, ИАН, постоянством термостатной температуры, неизменностью фактора времени.
Определение апоптоза нейтрофилов в кожном «окне» было выполнено у 125 больных ХГС (90 женщины, 35 мужчин), находившихся на лечении в Гепатологическом центре МЛПУЗ «Городская больница №1 им. Н.А.Семашко» г. Ростова-на-Дону в период 2008-2011 гг. Критериями включения пациентов в исследование явились: 1) наличие в крови суммарных аntiНСV, выявленных, как минимум, двукратно в условиях нескольких независимых лабораторий; 2) положительный результат детекции РНК НСV в крови; 3)срок наблюдения не менее 1 года; 4) отсутствие ранее проводимой терапии препаратами рибавирина и ИФНα; 5)отсутствие тяжелых сопутствующих соматических заболеваний, в том числе и других вариантов гепатитов; 6) отсутствие аутоиммунной патологии; 7) отсутствие декомпенсации заболевания с развитием цирроза печени. Исследуемые лица были равнозначны по своим исходным клинико-лабораторным данным и не имели противопоказаний к проведению антивирусной терапии. Генотипирование НСV осуществляли методом праймерспецифической ПЦР с использованием тест-систем «Амплисенс НСV генотип» фирмы «Интерлабсервис» (Россия). Генотип 1b HCV регистрировался в 54,4 % случаев, 3а - в 25,6 %, 2а - в 16,8 %. У 4 больных генотип HCV не был идентифицирован. Количество РНК HCV менее 3×105 МЕ/мл было отмечено у 24,0 % наблюдавшихся лиц, от 3×105 МЕ/мл до 6×105МЕ/мл - у 60,8 % и более 6×105МЕ/мл - у 15,2 %. Средний возраст обследованных составил 38,2±7,4 лет, длительность заболевания - 11,7±5,6 лет.
Статистическая обработка данных была проведена пакетом Microsoft Excel, о достоверности отличий учитываемых показателей судили по величине t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
Исследование апоптоза нейтрофилов у больных ХГС проводилось перед началом у них КПТ. Качественный состав мазков-отпечатков кожи у больных ХГС был представлен нейтрофилами, макрофагами и лимфоцитами. Относительное количество указанных клеток, выделяемых на стекло с кожи правого предплечья контрольного «окна», составило соответственно 63,8±2,6 %, 33,1±2,9 % и 3,1±0,4 %. Количественный состав клеток в мазках-отпечатках с кожи левого предплечья, т.е. опытного «окна» был практически идентичным (р>0,05).
Процент нейтрофилов, подвергнутых спонтанному апоптозу на правом предплечье, у 125 больных ХГС составил в среднем 7,5±0,07 %. Следует отметить, что на левом предплечье у 108 пациентов (86,4 %) уровень индуцированного апоптоза не имел достоверных отличий с контролем (7,7±0,09 %, р>0,05). У оставшихся 17 больных ХГС (13,6 %) процент сегментоядерных нейтрофилов, вступивших в апоптоз под действием ИАН, составил 62,5±3,11%, что значительно превысило средний показатель спонтанного апоптоза у этих пациентов на правом предплечье (р<0,001).
После определения индуцированного апоптоза нейтрофилов в кожном «окне» всем наблюдаемым лицам проводилась КПТ по схеме: «Альтевир» 3 млн. МЕ внутримышечно 3 раза в неделю и «Ребетол» 800-1200 мг в сутки перорально 24-72 недели в зависимости от генотипа HCV, уровня вирусной нагрузки, а также частоты появления быстрого и раннего вирусологического ответа.
В процессе лечения минимум 1 раз в неделю у больных определялся уровень нейтрофилов в крови с помощью гематологического анализатора «MEK-8222» (Nihon Kohden, Япония). Среднее значение абсолютного числа нейтрофилов (АЧН) у больных ХГС перед курсом КПТ составило 3,6±0,09×109/L. Динамическое наблюдение за пациентами в течение всего периода КПТ показало, что статистически значимое снижение АЧН отмечалось на 8-10 неделях лечения, достигнув в среднем 1,9±0,05×109/L, р<0,001.
Проведя корреляционный анализ, мы констатировали наличие обратной связи между средним значениями индуцированного апоптоза нейтрофилов в кожном «окне» у и уровнем АЧН на 8-10 неделях КПТ (r=-0,65; р<0,001). Так, у тех пациентов, у которых показатель индуцированного апоптоза нейтрофилов в кожном «окне» составил 8,2±0,09 %, минимальное количество нейтрофилов оставалось в пределах 2,2±0,04×109/L, что не требовало дополнительной коррекции лечения. Значительно более выраженная нейтропения отмечалась у тех больных ХГС, которые имели в начале исследования среднее значение индуцированного апоптоза нейтрофилов 62,5±3,11 %, так минимальный уровень нейтрофилов в этой группе пациентов составил в среднем 0,64±0,04×109/L, что оказалось достоверно ниже (р<0,01), чем у остальных, причем у 3-х из них АЧН к 8-10 неделе лечения снизилось до 0,45×109/L, что привело к отмене проводимой КПТ.
Наличие обратной корреляционной связи позволило разработать нам способ ориентировочного прогноза развития интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении у больных ХГС in vivo (Способ прогноза интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении у больных хроническим гепатитом С, получающих комбинированную противовирусную терапию. Заявка на изобретение № 2011102092, приоритет от 20.01.2011.) Было установлено, что при выявлении у пациентов показателя индуцированного апоптоза нейтрофилов в кожном «окне» ≥ 40 %, с вероятностью более 84 % можно судить о высоком риске развития у них нейтропении, при проведении им в дальнейшем КПТ. Данный способ технически прост и экономичен, обеспечивает быстрое получение результата и не требует для своего проведения специально оборудованной лаборатории.
Обсуждение
Как известно, успех современного лечения ХГС в значительной степени лимитируется рядом факторов, к которым относятся генотип НСV, уровень вирусной нагрузки, возраст больного в период лечения, различные внепеченочные поражения, темп прогрессирования фиброза печени, наличие вирусного стеатоза и др. Неблагоприятное фоновое состояние больных ХГС уменьшает результативность лечения, способствуя формированию нежелательных эффектов проводимой терапии, в том числе и развитию интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении. Результаты, полученные нами при исследовании 125 больных хронической HCV-инфекцией, позволяют сделать следующие выводы:
- Индукция апоптоза нейтрофилов препаратами рибавирина и ИФНα имеет важное патогенетическое значение в развитии нейтропении у сенсибилизированных к ним больных ХГС.
- Высокие значения индуцированного апоптоза нейтрофилов в «окне» ≥40 % являются прогностически неблагоприятным признаком развития нейтропении у данной категории пациентов при последующем назначении им препаратов интерферона-α и рибавирина.
Рецензенты:
- Яговкин Э.А., д.м.н., ст. научный сотрудник, заместитель директора Ростовского научно-исследовательского института микробиологии и паразитологии Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону.
- Ермолова Н.В., д.м.н., ст. научный сотрудник ФГУ «Ростовского научно-исследовательского института акушерства и педиатрии» Минздравсоцразвития, г. Ростов-на-Дону.
Работа получена 26.10.2011.
Библиографическая ссылка
Донцов Д.В., Амбалов Ю.М. СПОСОБ ПРОГНОЗА РАЗВИТИЯ НЕЙТРОПЕНИИ IN VIVO ПО REBUCK У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ С // Современные проблемы науки и образования. – 2011. – № 5. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=4873 (дата обращения: 19.04.2024).