Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ МЕТОДОМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ

Поляков В.В. 1 Рубашкина М.В. 1 Смирнов В.А. 1 Полякова В.В. 1
1 Технологический институт Южного федерального университета в г. Таганроге, г. Таганрог, Россия
В данной работе представлены результаты исследования живых микроорганизмов (Lactobacillus GG, Bifidobacterium lactis) методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) в жидкой и газовой средах. Проведена оценка эффективности применения бесконтактного режима АСМ для изучения влияния среды сканирования и времени инкубации образца на его параметры. Также представлены результаты экспериментальных исследований влияния свойств подложки на степень адгезии микроорганизмов на ее поверхность при сканировании в жидкости. Продемонстрирована принципиальная возможность применения современных методик АСМ для развития новых неразрушающих методов диагностики и визуализации биологических материалов, даже в условиях in vitro.
атомно-силовая микроскопия
бесконтактный режим
бактерия
адгезия
1. Morita S., Giessibl F., Sugawara Y., Hosoi H., Mukasa K., Sasahara A., Onishi H. Noncontact Atomic Force Microscopy and its related topics // Springer Handbook of Nanotechnology, Springer Berlin. – 2004. – 13. – P. 141–178.
2. Рубашкина М.В. Влияние свойств подложки на результаты исследований биологических объектов методом атомно-силовой микроскопии в жидкости // Материалы X Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов «Техническая кибернетика, радиоэлектроника и системы управления». – 2010. – С. 16.
3. Lindsay S. The scanning probe microscope in biology // Bonnell D. (Ed.) – 2001. – P. 289–335.
4. Поляков В.В., Смирнов В.А., Рубашкина М.В. Исследование параметров биологических объектов бесконтактным методом атомно-силовой микроскопии в жидкости // Труды международной научно-технической конференции и молодежной школы-семинара «Нанотехнологии – 2010». – 2010. – Ч. 2. – С. 251–253.
В последние годы большое внимание уделяется возможности использования биологических структур для получения новых материалов, биосенсоров и биоэлектронных устройств. В связи с этим важной задачей современной науки является исследование морфологии биологических объектов, так как именно размеры и форма во многом определяют принцип их функционирования. Новые возможности для исследования параметров биообъектов дает атомно-силовая микроскопия (АСМ), позволяющая проводить сканирование без специальной пробоподготовки, на воздухе или в жидкой среде [1].

Специальные конструкции сканирующих зондовых микроскопов, адаптированные для биологических исследований, такие как зондовая нанолаборатория Ntegra Vita (производитель - ЗАО «Нанотехнология-МДТ», г. Зеленоград), позволяют исследовать поверхность различных биологических объектов на воздухе и в жидких средах в сочетании с оптическим наблюдением процесса сканирования в реальном времени. Широкое распространение метода АСМ для изучения различных биоорганизмов связано с тем, что в отличие от других методов (оптической и электронной микроскопий) не требуется длительная, сложная и дорогостоящая подготовка образца.

Как известно, многие биообъекты обладают малой механической жесткостью, поэтому при исследовании необходимо свести до минимума возможность контакта зонда с их поверхностью. В связи с этим целями работы являются разработка методики определения параметров живых биологических объектов методом бесконтактной АСМ, а также изучение влияния среды на результаты АСМ-сканирования.

В качестве экспериментального образца использовалась биологически активная добавка «Бифиформ® Малыш» (производитель - «Ферросан А/С», Дания), форма выпуска - порошок. В состав порошка входили следующие компоненты: Lactobacillus GG (LGG) (109 КОЕ/г) - 3,33 мг, Bifidobacterium lactis (BB-12) (109 КОЕ/г) - 3,33 мг, Витамин B1 - 0,40 мг, Витамин B6 - 0,50 мг. Данный порошок разводился дистиллированной водой в соотношении 1:10. Исследования осуществлялись на зондовой нанолаборатории Ntegra Vita (производитель - ЗАО «Нанотехнология-МДТ», г. Зеленоград) с использованием поставляемых в комплекте принадлежностей и применением пакета прикладных программ Nova (1.0.26.1324). В качестве зонда применялся кремниевый кантилевер марки NSG 10.

Во время наблюдения данного образца с помощью встроенного инвертированного оптического микроскопа было обнаружено, что раствор порошка «Бифиформ» содержал большое количество подвижных бактерий, а также их достаточно крупные малоподвижные скопления, выделенные черной линией (рис. 1).

Исследование подвижных бактерий без применения специальных фиксаторов было невозможно, поэтому сканирование в полуконтактном режиме АСМ проводилось на малоподвижных скоплениях, АСМ-изображение которых показано на рис. 2. Анализ полученных АСМ-изображений проводился с использованием программного пакета Image Analysis 3.5 (ЗАО «Нанотехнология-МДТ», г. Зеленоград). В результате было показано, что исследуемый раствор содержал объекты овальной формы размерами 0,5-1,5 мкм, иногда в коротких цепочках длиной 1,0-5 мкм.

Рис. 1. Оптическая фотография раствора порошка «Бифиформ» с увеличением 25×

Рис. 2. АСМ-изображение раствора порошка «Бифиформ», полученное полуконтактным методом АСМ в жидкости

 

Следующим этапом работы являлось исследование зависимости параметров живых бактерий от времени инкубации. На рис. 3 показаны АСМ-изображения биологических объектов раствора «Бифиформ», полученные полуконтактным методом АСМ в жидкости после одного часа инкубации (рис. 3а) и через 2 месяца инкубации (рис. 3б).

 

a                                                                                         б

Рис. 3. АСМ-изображение раствора порошка «Бифиформ»: а) время инкубации 1 час; б) время инкубации 2 месяца

Анализ полученных АСМ-изображений показал, что наблюдается значительное увеличение количества бактерий и их размеров по истечении 2 месяцев инкубации. После одного часа инкубации наблюдались объекты овальной и сферической формы, объединенные в цепочки длиной 1-5 мкм. После 2 месяцев инкубации биологические объекты преимущественно имели сферическую форму диаметром 0,5-1 мкм и высотой до 200 нм [2].

Т.к. исследуемые биообъекты имели мягкую поверхность, то для минимизации повреждения исследуемого образца в процессе сканирования была разработана методика, основанная на использовании бесконтактного режима работы АСМ, который является частным случаем полуконтактного метода, когда зонд в результате подбора определенных параметров сканирования взаимодействует с поверхностью образца только за счет сил притяжения, и его контакт с поверхностью тем самым исключается. Такая методика имеет существенное преимущество при исследовании мягких, вязких или хрупких образцов, а также при использовании дорогостоящих зондов.

Для исследования влияния среды, в которой проходит сканирование, на получаемую с помощью метода АСМ морфологию биоорганизмов проводилось сканирование раствора порошка «Бифиформ® Малыш» бесконтактным методом АСМ в двух различных средах: на воздухе и в жидкости. В первом случае раствор осаждался на ситалловую подложку и высушивался в течение 20 минут в закрытой чашке Петри, во втором проводилось непосредственное сканирование в капле данного раствора на подложках из различных материалов: предметное стекло, пластмасса (чашка Петри), ситалл и нержавеющая сталь (подложкодержатель жидкостной ячейки MP6LCNTF). Это позволило исследовать влияние свойств подложки, на которую осаждается раствор, на результаты сканирования и выявить зависимость степени адгезии исследуемого образца от выбора материала подложки.

Анализ полученных АСМ-изображений раствора порошка «Бифиформ» (рис. 4) показал, что бактерии при исследовании на воздухе (рис. 4а) имели меньшие геометрические размеры по сравнению с бактериями в жидкости (рис. 4б), что связано с высыханием мягкой оболочки биообъекта и искажением его формы. Результаты измерений в жидкости, с использованием разработанной методики (рис. 4б), хорошо коррелировали с результатами, полученными в полуконтактном режиме АСМ (рис. 3а).

 

а                                                                                                   б

Рис. 4. АСМ-изображения раствора порошка «Бифиформ», полученные бесконтактным методом АСМ: а) на воздухе; б) в жидкой среде

В ходе проведенных ранее экспериментов было выявлено, что значительное влияние на результаты сканирования биообъектов в жидкости оказывают силы гидратации (гидрофобно-гидрофильное взаимодействие подожки и образца). Известно, что большинство биообъектов при взаимодействии с водой выставляют гидрофильные группы на внешнюю поверхность, поэтому можно предположить, что для хорошей адсорбции биообъектов на подложку необходимо использовать гидрофильные подложки [3]. Поэтому было проведено исследование адсорбции бактерий из раствора порошка «Бифиформ® Малыш» на поверхность подложки различных материалов. На рис. 5 приведены полученные АСМ-изображения.

 

а                                                                                         б

 

в                                                                                        г

Рис. 5. АСМ-изображения поверхности раствора порошка «Бифиформ® Малыш», полученные на подложке: а) стеклянной; б) пластмассовой; в) ситалловой; г) металлической

Анализ данных изображений показал, что на гидрофобной пластмассовой подложке осаждение бактерий не наблюдалось (рис. 5а), на стеклянной - осаждение было незначительно (рис. 5б) и сила связи бактерий с подложкой мала. Ситалловая гидрофильная подложка обеспечивает осаждение бактерий преимущественно в один слой и выступает хорошим адсорбентом для биообъектов (рис. 5в). При использовании металлической подложки наблюдалось значительное осаждение бактерий в несколько слоев, что связано с высокой гидрофильностью окисного слоя на поверхности металла (рис. 5г) [4].

В результате проведенной работы показано, что бесконтактный режим АСМ в жидкости является наиболее перспективным режимом АСМ, который позволяет проводить исследования живых микроорганизмов без применения специальной пробоподготовки и с минимальным воздействием на их поверхность во время сканирования. Установлено, что для получения достоверных результатов измерений методом АСМ сканирование поверхности живых микроорганизмов необходимо проводить в условиях, близких к естественным, в данном случае - в жидкой среде. Показано, что выбор подложки играет определяющую роль при исследовании биообъектов методом АСМ, и для получения положительных результатов сканирования необходимо использовать гидрофильные подложки, т.к. они обеспечивают необходимую адгезию образца на свою поверхность. Полученные результаты могут быть использованы при разработке неразрушающих методов визуализации биологических объектов в условиях in vitro.

Рецензенты:

  • Агеев О.А., д.т.н., профессор, директор научно-образовательного центра «Нанотехнологии», г. Таганрог.
  • Рындин Е.А., д.т.н., профессор, ведущий научный сотрудник Южного научного центра РАН, зам. директора ООО «Центр нанотехнологий», г. Ростов-на-Дону.

Работа получена 16.09.2011


Библиографическая ссылка

Поляков В.В., Рубашкина М.В., Смирнов В.А., Полякова В.В. ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ МЕТОДОМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ // Современные проблемы науки и образования. – 2011. – № 4.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=4760 (дата обращения: 20.09.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074