Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,737

ВЛИЯНИЕ ИММОБИЛИЗАЦИИ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛАКТОБАКТЕРИЙ

Столбова М.Г. 1 Несчисляев В.А. 1 Мокин П.А. 1 Орлова Е.В. 1 Маслов Ю.Н. 2
1 Филиал АО «НПО «Микроген» в г. Пермь «Пермское НПО «Биомед»
2 ФГБОУ ВО ПГМУ им. академика Е.А. Вагнера
Цель данной работы - исследование влияния иммобилизации на устойчивость к действию модельных сред, имитирующих условия пищеварения в желудке и кишечнике человека, и на антагонистические свойства лактобактерий. В исследовании использовали образцы лиофилизированной биомассы лактобактерий штамма Lactobacillus plantarum 8P-A3, иммобилизованных на различных сорбентах (гомогенат бурых водорослей, альгинат натрия, отруби пшеничные ферментированные, лигнин гидролизный, микрокристаллическая целлюлоза, каолин) и препарат лактобактерин. В качестве модельных сред использовали кислый раствор пепсина, щелочной раствор панкреатина и желчь. Определение антагонистической активности образцов проводили с помощью теста отсроченного антагонизма и теста подавления биолюминесценции индикаторного штамма Escherichia coli lum+. Эксперименты показали, что иммобилизация клеток позволяет повысить резистентность лактобактерий к действию модельных сред, имитирующих секреты желудочно-кишечного тракта человека. Установлено, что выраженными протективными свойствами обладают сорбенты на основе бурых водорослей (ламинарии и фукуса). Данные, полученные при использовании двух методических подходов свидетельствуют о наличии выраженных антагонистических свойств у всех изученных образцов лактобактерий, а процесс иммобилизации клеток не оказывает негативного влияния на их биологическую активность.
лактобактерии
иммобилизация
антагонистическая активность
1. Ардатская М.Д. Дисбиоз (дисбактериоз) кишечника: современное состояние проблемы, комплексная диагностика и лечебная коррекция / М.Д. Ардатская и др. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. – 2015. – № 117 (5). – С. 13–50.
2. Барановский А.Ю. Дисбактериоз кишечника / А.Ю. Барановский, Э.А. Кондрашина. – СПб: Питер, 2008. – 240 с.
3. Новокшонов А.А. Физиологические функции лактобактерий в организме и эффективность их применения в составе пробиотиков в педиатрической практике / А.А. Новокшонов, Н.В. Соколова // Эпидемиология и инфекции – 2012. – № 1. – С. 52–56.
4. ОФС.1.7.2.0009.15 Определение специфической активности пробиотиков / Государственная фармакопея РФ, изд. XIII / Т. 1, 2 http://www.femb.ru/feml
5. Несчисляев В.А., Пшеничнов Р.А., Арчакова Е.Г., Чистохина Л.П., Фадеева И.В. Способ определения антагонистической активности пробиотиков // Патент на изобретение № 2187801 от 20.08.2002 г. Бюл. № 23.

Кишечная микрофлора является важнейшим составным компонентом сложной экологической системы организма человека. В настоящее время отмечается пристальное внимание к проблеме дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта человека и способам их коррекции. Современные принципы восстановления нормального микробиоценоза включают широкий арсенал мероприятий, среди которых важная роль отводится применению биологических препаратов – пробиотиков [1, 2].

Лекарственные средства на основе лактобактерий находят широкое применение в составе комплексной терапии различных заболеваний и обеспечивают нормализацию микрофлоры кишечника. Устойчивость лактобактерий к действию ингибирующих факторов желудочно-кишечного тракта человека и антагонизм в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, связанные с выработкой молочной кислоты, перекиси водорода, лизоцима и продуктов с высокой антибиотической активностью, определяют клиническую эффективность пробиотических препаратов на их основе [3].

Цель исследования

Оценка влияния иммобилизации на устойчивость к действию модельных сред, имитирующих условия пищеварения в желудке и кишечнике человека, и на антагонистические свойства лактобактерий.

Материал и методы исследования

В работе использовали производственный штамм лактобактерий Lactobacillus plantarum 8P-A3. В качестве сорбентов применяли гомогенат бурых водорослей, альгинат натрия, отруби пшеничные ферментированные, лигнин гидролизный, микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ) и каолин. Для сравнения использовали препарат лактобактерин с неиммобилизованными клетками (АО НПО «Микроген», Россия).

Для проведения процесса иммобилизации раствор сорбента добавляли к нативной взвеси лактобактерий и перемешивали в течение 30 мин. После этого культуру иммобилизованных клеток выдерживали в течение 5 суток при температуре (5±3) °С и визуально оценивали полноту иммобилизации по характеру расслоения исследуемой взвеси с последующим определением количества живых бактерий в надосадочной жидкости. Расслоение взвеси на плотный осадок и прозрачную надосадочную жидкость свидетельствует о том, что большая часть лактобактерий находится в связанном состоянии.

Для получения сухой биомассы бактериальную суспензию разливали в металлические кассеты с толщиной слоя до 15 мм и подвергали лиофильному высушиванию в сублимационной установке ТГ-50 (Германия) в течение не менее 44 ч с предварительным замораживанием при температуре –(50±10) ºС. В качестве ксеропротектора использовали сахарозо-желатино-молочную среду. Лиофилизированную биомассу извлекали из кассет, протирали через сито с ячейками на 0,25 мм и хранили в герметично закрытых контейнерах при температуре (5±3) ºС.

При моделировании условий пищеварения использовали кислый раствор пепсина (3 г пепсина, 6 мл концентрированной соляной кислоты, до 1 л воды очищенной, рН 1,8±0,2), щелочной раствор панкреатина (3 г панкреатина, 15 г натрия гидрокарбоната, до 1 л воды очищенной, рН 8,2±0,2) и желчь медицинскую консервированную (ООО «САМСОН-МЕД», рН 7,2). Образцы сухой биомассы регидратировали в растворе натрия хлорида 0,9%-ном и инкубировали при (37±1) °С в кислом растворе пепсина в течение 30 мин, в щелочном растворе панкреатина и желчи – в течение 2 ч, контрольные образцы – в растворе натрия хлорида 0,9%-ном. Для определения показателя КОЕ до и после окончания инкубации в модельных средах использовали стандартную методику посева последовательных десятикратных разведений на плотную питательную среду МРС-4.

Определение антагонистических свойств образцов проводили с использованием методики отсроченного антагонизма [4] и теста подавления биолюминесценции индикаторного штамма Escherichia coli lum+ [5].

Экспериментальные образцы лактобактерий регидратировали раствором натрия хлорида 0,9%-ного и высевали по периметру чашки Петри бактериологической петлей на плотную среду МРС-5. Посевы инкубировали в аэробных условиях в течение 2 суток при температуре (37±1) °С. Индикаторную культуру штамма E. coli 157 выращивали на мясо-пептонном агаре в течение 1 суток в аэробных условиях, затем смывали раствором натрия хлорида 0,9%-ного, доводили оптическую плотность до 5 единиц по ОСО 42-28-86-86 и подсевали в виде «перпендикулярных штрихов» к выросшей культуре лактобактерий. Результаты учитывали через 1 сутки инкубации при температуре (37±1) °С по размеру зон подавления роста тест-штамма.

Для исследования антагонистической активности в экспресс-тесте угнетения биолюминесценции экспериментальные образцы и индикаторный штамм E. coli lum+ регидратировали раствором натрия хлорида 0,9%-ным. Регидратированную тест-культуру выдерживали не менее 30 мин при температуре (5±3) °С и доводили ее объем до 50 мл. При подготовке опытной пробы 0,5 мл исследуемого образца лактобактерий, разведенного раствором натрия хлорида 0,9%-ного в 10 раз, смешивали с 0,5 мл штамма-индикатора. При подготовке контрольной пробы к 0,5 мл индикаторной культуры добавляли 0,5 мл раствора натрия хлорида 0,9%-ного. Через определенные промежутки времени (10 мин, 1, 2, 4, 6 и 24 ч) проводили регистрацию уровня свечения тест-штамма с помощью люминометра «Биотокс-10М» (ООО «НЕРА-С», Россия), который автоматически вычислял индекс антагонистической активности (ИАА). ИАА представляет собой безразмерную величину, численно равную проценту подавления свечения индикаторного штамма по сравнению с исходным уровнем.

Обработку полученных данных проводили в программе MS Excel. Результаты представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней (М ± m). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты исследования и обсуждение

Полученные результаты исследования процесса иммобилизации клеток свидетельствуют о высокой эффективности всех использованных сорбентов – полнота связывания составила более 90%, наиболее эффективными являются носители на основе фукуса лиофилизированного, отрубей ферментированных и полифепана (табл. 1).

Таблица 1

Иммобилизация лактобактерий

Сорбент

Концентрация сорбента

в рабочем растворе

КОЕ/мл

Полнота

иммоби-

лизации,

%

Взвесь иммобилизованных клеток

L. plantarum 8P-A3

Надосадочная жидкость

Ламинария лиофилизированная

2,5%

5,60×109

1,75×108

> 95

Ламинарии слоевища измельченные

5%

4,30×109

0,93×108

> 95

Фукус лиофилизированный

5%

5,35×109

1,05×108

> 98

Альгинат натрия

2,5 %

4,25×109

2,00×108

> 95

Отруби пшеничные ферментированные

5%

5,03×109

0,95×108

> 98

Лигнин гидролизный

10%

5,40×109

0,65×108

> 98

МКЦ

15%

4,45×109

1,00×108

> 95

Каолин

15%

6,50×109

1,90×108

> 95

Контроль (бакт. взвесь без сорбента)

5,80×109

1,90×109

 

Следующим этапом исследований было изучение устойчивости иммобилизованных лактобактерий к действию модельных сред, имитирующих условия пищеварения в желудке и кишечнике человека. До экспозиции в модельных средах количество жизнеспособных лактобактерий в регидратированных образцах иммобилизованной биомассы и в контрольном образце составляло не менее 109 КОЕ/мл. После инкубации в кислом растворе пепсина показатель КОЕ снизился на 3 порядка в образцах с сорбентами на основе ламинарии лиофилизированной, термически высушенного порошка ламинарии и фукуса лиофилизированного. Сорбенты на основе альгината натрия, отрубей пшеничных ферментированных и лигнина гидролизного оказали менее выраженный протективный эффект – после действия кислого раствора пепсина количество жизнеспособных лактобактерий в этих образцах сохраняется на уровне не ниже 105 КОЕ/мл (снижение показателя КОЕ на 4 порядка). Выраженная чувствительность к действию кислого раствора пепсина отмечена в образцах биомассы с МКЦ, каолином и в контрольном образце без сорбента.

После 2-часовой экспозиции в желчи показатель КОЕ сохраняется на уровне 109 КОЕ/мл в образцах биомассы лактобактерий, иммобилизованных с применением лиофилизированного порошка ламинарии и фукуса, снижение выживаемости на один порядок отмечено в образцах с ламинарией и лигнином гидролизным.

Щелочной раствор панкреатина не оказал значительного влияния на выживаемость лактобактерий – уровень показателя КОЕ снизился на 1 порядок во всех испытуемых образцах после 2-часовой экспозиции (табл. 2).

Таблица 2

Выживаемость иммобилизованных лактобактерий в модельных средах

Сорбент

Количество жизнеспособных клеток, КОЕ/мл

Исходное

Кислый раствор пепсина, экспозиция

30 мин

при (37±1) ºС

Желчь,

экспозиция 2 ч

при (37±1) ºС

Щелочной раствор панкреатина, экспозиция 2 ч

при (37±1) ºС

Ламинария лиофилизированная

3,25(±1,19)×109

3,58(±1,06)*×106

2,10(±0,42)×109

2,67(±0,49)*×108

Ламинарии слоевища измельченные

4,33(±1,29)×109

2,50(±0,65)*×106

3,50(±0,65)*×108

2,33(±0,61)*×108

Фукус лиофилизированный

3,58(±0,59)×109

3,40(±0,91)*×106

1,85(±0,72)*×109

2,57(±0,33)*×108

Альгинат натрия

4,18(±0,44)×109

0,93(±0,12)*×106

1,93(±0,05)*×107

1,80(±0,47)*×108

Отруби пшеничные

ферментированные

4,60(±0,70)×109

1,45(±0,22)*×105

1,40(±0,24)*×107

1,85(±0,32)*×108

Лигнин гидролизный

3,67(±0,67)×109

1,60(±0,47)*×105

1,75(±0,30)*×108

2,22(±0,57)*×108

МКЦ

3,33(±0,88)×109

1,53(±0,21)*×104

1,35(±0,24)*×107

1,90(±0,46)*×108

Каолин

3,90(±0,42)×109

1,70(±0,26)*×104

2,88(±0,30)*×107

1,64(±0,15)*×108

Контроль

4,00(±0,41)×109

2,88(±0,30)*×104

3,35(±0,47)*×107

2,00(±0,77)*×108

* – р<0,05 по сравнению с исходным значением

Защитные свойства носителей на основе ламинарии, фукуса и альгината натрия можно объяснить тем, что данные сорбенты, взаимодействуя с желудочным соком, образуют изотропный гель с включенными в него лактобактериями. Получаемая «гелевая капсула» защищает клетки от дальнейшего воздействия соляной кислоты и пепсина желудочного сока, сохраняя их выживаемость. В тонком кишечнике «капсула» растворяется, происходит высвобождение лактобактерий.

Лигнин гидролизный и отруби пшеничные ферментированные представляют собой растительные волокна, на поверхности которых сорбируются бактерии, что способствует их устойчивости к действию желудочного сока и желчи.

Результаты контроля антагонистической активности иммобилизованных лактобактерий методом «перпендикулярных штрихов» представлены в таблице 3.

Таблица 3

Антагонистическая активность иммобилизованных лактобактерий по отношению к E. coli 157

№ серии

биомассы

Сорбент

Зона задержки роста тест-штамма, мм

1

Ламинария лиофилизированная

40,14±0,40

2

Ламинарии слоевища измельченные

39,57±0,69

3

Фукус лиофилизированный

41,17±0,70

4

Альгинат натрия

39,33±0,95

5

Отруби пшеничные

ферментированные

39,17±1,08

6

Лигнин гидролизный

40,33±0,99

7

МКЦ

37,83±0,91

8

Каолин

39,40±1,08

Контроль

39,67±0,49

 

У всех образцов зона подавления роста тест-штамма превышала нормируемый минимум (20 мм) примерно в 2 раза. Статистически значимых различий между активностью иммобилизованных и свободных клеток не выявлено.

В экспресс-тесте подавления биолюминесценции индикаторного штамма E. coli lum+ все исследуемые образцы лактобактерий проявляли схожую динамику ингибирования свечения, которая характеризовалась последовательным увеличением ИАА, максимум которого (практически 100% подавления) наблюдали к 24 ч экспозиции, за исключением биомассы № 8 с сорбентом на основе каолина (рис. 1).

Влияние лактобактерий на биолюминесценцию E. coli lum+

Различия между образцами наблюдались в степени подавления свечения индикаторного штамма в течение 4 ч экспозиции. Низкий уровень подавления свечения (меньше 40%) отмечен у образцов иммобилизованных лактобактерий с сорбентом на основе альгината натрия и каолина. Средний уровень угнетения биолюминесценции (от 40 до 80%) проявляли образцы с сорбентом на основе фукуса, отрубей пшеничных ферментированных, лигнина гидролизного и каолина. Образцы лактобактерий, иммобилизованных на ламинарии, и лактобактерин (контроль) подавляли свечение тест-штамма на уровне выше 80%.

Заключение

Таким образом, эксперименты по изучению выживаемости лактобактерий в модельных средах показали, что иммобилизация клеток позволяет повысить резистентность лактобактерий к действию модельных сред, имитирующих секреты желудочно-кишечного тракта человека. Установлено, что выраженными протективными свойствами обладают сорбенты на основе бурых водорослей (ламинарии и фукуса).

Данные, полученные при использовании двух методических подходов, свидетельствуют о наличии выраженных антагонистических свойств у всех изученных образцов лактобактерий, а процесс иммобилизации клеток не оказывает негативного влияния на их биологическую активность.


Библиографическая ссылка

Столбова М.Г., Несчисляев В.А., Мокин П.А., Орлова Е.В., Маслов Ю.Н. ВЛИЯНИЕ ИММОБИЛИЗАЦИИ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛАКТОБАКТЕРИЙ // Современные проблемы науки и образования. – 2018. – № 4.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=27975 (дата обращения: 19.06.2019).


Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252