Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,931

РЕАКЦИЯ БРЮШИНЫ МЫШЕЙ ПРИ ИНТРАПЕРИТОНЕАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ ДЕТОНАЦИОННЫХ НАНОАЛМАЗОВ

Жуков Е.Л. 2 Инжеваткин Е.В. 1, 2 Медведева Н.Н. 2
1 ФГБУН «Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской Академии Наук»
2 ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России
Исследовано влияниедетонационных наноалмазов на брюшину мышей. Экспериментальным животным, разделенным на группы, в полость брюшины вводили по 1 мл деионизованной воды илистерильного гидрозоля наноалмазов с концентрацией20мкг/мл. Через трое суток после инъекцииживотных выводили из эксперимента и оценивали активацию перитонеальных макрофагов по степени выраженности блеббинга плазмолеммы и толщину листков брюшины. Полученные данные сравнивали с аналогичными показателями интактных животных. Установлено, что наноалмазы введенные в полость брюшины, вызывают активацию перитонеальных макрофагов, проявляющуюся в увеличении индекса блеббинга; утолщение париетального и висцерального листков брюшины. Показано, что деионизованная вода, используемая в качестве дисперсионной среды при приготовлении гидрозоля наноалмазов, также вызывает увеличение индекса блеббинга и утолщение обоих листков брюшины, но в меньше степени.
брюшина.
перитонеальные макрофаги
блеббинг плазмолеммы
гидрозоль наноалмазов
наноалмаз
1. Гланц С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. – М.: Практика, 1999. – 460с.
2. Каркищенко, Н.Н. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях. – М.: Медицина, 2010. – 344с.
3. Клаус Д. Лимфоциты. Методы: пер. с англ. – М.: Мир, 1990. – 395с.
4. Коржевский Д.Э., Гиляров А.В. Основы гистологической техники. – СПб: Спецлит, 2010. – 95с.
5. Лазаренко Л.И., Жуков Е.Л., Кругом С.В. и др. Эффект действия детонационных наноалмазов на здоровые ткани пародонта экспериментальных животных и при их воспалительно-деструктивных изменениях//Сибирское медицинское обозрение. – 2008. – №6(54). – С.27-31.
6. Медведева Н.Н. Жуков Е.Л., Инжеваткин Е.В. и др. Изучение противоопухолевых свойств модифицированных наноалмазов детонационного синтеза и сорбированного на них доксорубицина на примере асцитной карциномы Эрлиха// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2015. – №15. – С.360-363.
7. Пузырь А.П., Бондарь В.С. Способ обработки наноалмазов//Патент России №2258671 С2. 2005. Бюл. № 23.
8. Пузырь А.П., Бондарь В.С. Способ получения наноалмазов взрывного синтеза с повышенной коллоидной устойчивостью // Патент России №2252192 C2. 2005. Бюл. № 14.
9. Пузырь А.П., Бондарь В.С., Селимханова З.Ю. и др.Динамика некоторых физиологических показателей лабораторных мышей при длительном пероральном введении гидрозолей наноалмазов // Сибирское медицинское обозрение. – 2004. – № 4(33). – С.19-23.
10. IshchenkoL.A., StolyarS.V., InzhevatkinE.V.etal.Magnetic properties and application of фbiomineral particles produced by bacterial culture // Всборнике: Physics Procedia 12th International Conference on Magnetic Fluids, ICMF12. Сер. "12th International Conference on Magnetic Fluids, ICMF12" Sendai, 2010. – P. 279-282.

Развитие современных технологий в биомедицинских науках значительно расширяет методологическиевозможности ученого в совершенствовании и углублении знаний об этиологии, патогенезе и лечении различных заболеваний. Большой интерес представляет применение продуктов нанотехнологического прогресса для диагностики и лечения патологических процессов, в частности речь идет о наноалмазах детонационного синтеза[10]. Данные наночастицы имеют алмазное ядро из углерода, размером 4-5нм, покрытое снаружи различными химически активными группами. Небольшие размеры частиц и высокая химическая активность поверхности обеспечивают этому наноматериалу высокую сорбционную емкость - 1 грамм наноалмазов может сорбировать на себя до 0,5 граммов белка. Таким образом, наноалмазы можно использовать как сорбент при различных патологиях, требующих высокий уровень связывания и выведения различных нежелательных для организма веществ, в том числе и органической природы. Можно предполагать, что наноалмазы найдут свое применение как носитель лекарственных средств, энтеросорбент, раневое покрытие для инфицированных ран, для лечения гнойных перитонитов и т.п.[5,6]. Предварительные исследования показали, что наноалмазы обладают высокой биологической совместимостью[9].

Целью исследования было выявить реакцию организма экспериментальных животных на интраперитонеальное введение гидрозолей наноалмазов.

Материалы и методы исследования

В работе использовали наноалмазы, полученные в НПО «Алтай» (г. Бийск). Но данный наноматериал обладал существенным недостатком, общим для подавляющего большинства используемых наноалмазов - низкой коллоидной устойчивостью, что не позволяло получить устойчивый гидрозоль наночастиц, который можно было бы простерилизовать для инъекционного введения в полость брюшины без ухудшения качества гидрозоля. Поэтому проводили дополнительную очистку поверхности наночастиц по запатентованной методике [7,8]. В результате получали наноалмазы, которые способны образовывать устойчивые гидрозоли, и невыпадающие в осадок даже после стерилизации.

В работе использовали гидрозоль наноалмазов концентрации 0,002 вес.%, который получали простым добавлением деионизованной воды к навеске порошка наноалмазов. Затем гидрозоль разливали в чистую стеклянную тару, герметично укупоривали резиновой пробкой с алюминиевой обкаткой и стерилизовали в автоклаве.

В качестве экспериментальных животных использовали инбредных белых лабораторных мышей весом 26-28 грамм, самцов.

Животных случайным образом распределили на 3 группы:

1 группа - 11 животных - вводили 0,002 вес.% гидрозоль наноалмазов в полость брюшины.

2 группа - 10 животных - вводили деионизованную воду в полость брюшины.

3 группа - 10 животных - в полость брюшины ничего не вводили (контрольная группа).

Работу с экспериментальными животными осуществляли в виварии Красноярского государственного медицинского университета им.проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого с соблюдением требований гуманного обращения с экспериментальными животными согласно «Руководству по лабораторным животным иальтернативным моделям в биомедицинских технологиях» [2] после разрешения Локального Этического комитета ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. Ф.В. Войно-Ясенецкого Минздрава РФ (протокол № 26/2010 от 24.09.2010г).

Животных наркотизировали эфиром, обрабатывали переднюю брюшную стенку 70-градусным этиловым спиртом, и инсулиновым шприцем в полость брюшины вводили 1 мл гидрозоля наноалмазов или деионизованной воды, согласно распределению животных по группам. После пробуждения отсаживали животное в клетку. Через 72 часа после инъекции животное выводили из эксперимента путем дислокации позвоночника в шейном отделе.В полость брюшины вводили 5 мл раствора Хенкса, после чего массировали животному живот в течение 2 минут. После массажа откачивали с помощью шприца содержимое полости брюшины, из которого выделяли перитонеальные макрофаги, основываясь на их быстрой адгезии к стенкам культурального сосуда[3].

Клеточную суспензию с макрофагами наносили на обезжиренное предметное стекло, покрывали покровным стеклом и микроскопировали на микроскопе NikonEclipseNi-Uс насадкой для фазового контраста (увеличение х1000,масляная иммерсия). При микроскопии оценивали состояние плазмолеммы макрофагов, по морфологии которой выделяли 4 вида клеток и подсчитывали их количество: интактные макрофаги, макрофаги в состоянии начального блеббинга, макрофаги в состоянии терминального блеббинга, некротизированные макрофаги. Производили подсчет клеток в нескольких полях зрения (не менее 100 клеток от каждого животного). Полученные данные заносили в протокол исследования в формате электронной таблицы Excel, вычисляли процентное соотношение клеток по 4 видам для каждого животного. Также мы вычисляли индекс блеббинга макрофагов- выраженное в процентах отношение макрофагов в состоянии терминального блеббинга к количеству макрофагов в состоянии начального и терминального блеббинга.

Кроме этого, были взяты фрагменты тонкой кишки и передней брюшной стенки для исследования висцеральной и париетальной брюшины. Образцы органов фиксировали в 10% забуференном формалине в течение 24 часов, затем пропитывали парафином в автоматизированном гистологическом процессоре LeicaTP1020, заливали в парафиновые блоки, и изготавливали парафиновые срезы толщиной 5 мкм. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином и по методу Ван Гизон по стандартным протоколам [4]. Полученные гистологические препараты подвергали обзорной микроскопии на микроскопе NikonEclipseNi-Uс системой фото-видеодокументацииNikonDS-Fi2 и морфометрии с помощью программы JMicroVision 1.2.7.В препаратах измеряли толщину париетальной (передняя брюшная стенка) и висцеральной брюшины (тонкая кишка) в 5 полях зрениях от каждого животного, не менее 5 измерений в каждом поле зрения.

Для численного представления полученных параметров использовали медиану и квартили Me [Q1;Q3], сравнение проводили с помощью непараметрических методов статистики[1]. Так как было больше двух групп сравнения, то сначала мы использовали дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса (Kruskel-Wallis), который показал наличие различий показателей между группами. Далее для попарного сравнения использовали критерий Манна-Уитни (U-test) с поправкой Холма. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

При исследовании состояния перитонеальных макрофагов экспериментальных животных при интраперитонеальном введении гидрозолей наноалмазов был выявлено, что количество интактных клеток статистически значимо больше, чем некротизированных и клеток в состоянии блеббинга разной степени выраженности (р<0,01). Количество некротизированных клеток статистически значимо меньше, чем интактных и в состоянии блеббинга различной степени выраженности (р<0,01). Статистически значимых различий между количеством клеток в состоянии начального и терминальнного блеббинга не выявлено (р=0,97) (табл. 1).

Таблица 1

Соотношение перитонеальных макрофагов в различной степени блеббинга, в % (Me[Q1;Q3])

Состояние плазмолеммы перитонеальных макрофагов

Группа животных

Введение 1мл 0,002 вес.% гидрозоля наноалмазов

Введение 1мл деионизованной воды

Контрольные (интактные) животные

Интактные макрофаги

37,50[34,23;45,58]

63,83[58,47;66,06]

р1=0,0001

68,64[66,67;72,73]

р1=0,0001

р2=0,006

Начальный

блеббинг

25,16[20,69;26,00]

24,32[20,91;27,18]

р1=0,97

21,68[16,83;24,51]

р1=0,14

р2=0,15

Терминальный блеббинг

24,32[19,00;27,67]

8,87[7,77;10,62]

р1=0,0003

5,79[4,59;8,91]

р1=0,0002

р2=0,02

Некротизированные макрофаги

10,60[6,00;14,00]

4,61[3,54;5,74]

р1=0,002

2,86[2,44;3,92]

р1=0,0001

р2=0,03

Индекс

блеббинга

46,77[42,22;56,10]

28,02[25,81;30,00]

р1=0,0006

21,36[19,23;27,59]

р1=0,0003

р2=0,04

Примечание: р1 - уровень значимости «р» при сравнении с группой животных, которым вводили гидрозоль наноалмазов. р2 - уровень значимости «р» при сравнении с группой животных, которым вводили деионизованную воду.

После введения деионизованной воды в полости брюшины экспериментальных животныхинтактных макрофагов наблюдается статистически значимо больше (р<0,01), а клеток в состоянии некроза статистически значимо меньше (р<0,01). При этом клеток в состоянии начального блеббинга больше, чем в состоянии терминального (р<0,01) (табл. 1).

У животных контрольной группы, которым в полость брюшины ничего не вводили, количество интактных клеток статистически значимо больше, чем клеток в состоянии блеббинга и некротизированных (р<0,01). Некротизированных клеток наименьшее количество (р<0,01). Макрофагов в состоянии начального блеббинга больше, чем в состоянии терминального (р<0,01)(табл. 1).

При сравнении видов клеток у разных групп животных отмечается, что интактных макрофагов статистически значимо больше в контрольной группе животных, в группе животных, которым вводили гидрозоли наноалмазов интактных клеток наименьшее количество (табл. 1).

Количество перитонеальных макрофагов в состоянии начального блеббинга не имело статистически значимых различий у животных всех групп (табл. 1).

Перитонеальные макрофаги в состояниитерминального блеббинга в наибольшем количестве определяются в группе животных, которым вводили гидрозоль наноалмазов в полость брюшины. Наименьшее количество макрофагов в состоянии терминального блеббинга наблюдается в контрольной группе животных (табл. 1).

Некротизированные макрофаги также в наибольшем количестве выявлены в группе животных, которым интраперитонеально вводили наночастицы. В контрольной группе некротизированные макрофаги встречаются редко (табл. 1).

При расчете индекса блеббинга было установлено, что статистически значимое наибольшее значение этого показателя наблюдается при введении экспериментальным  животным гидрозоля наноалмазов, наименьшее - у животных контрольной группы(табл. 1).

При микроскопии брюшины животных, которым вводили гидрозоль наноалмазов, отмечается  отек соединительнотканной пластинки, мезотелия. Отдельные клетки мезотелия изменили плоскую форму на кубическую. В соединительнотканной пластинке наблюдается большое количество макрофагов с примесью лимфоцитов. У животных, которым в полость брюшины вводили деионизованную воду,реакция брюшины менее выражена: наблюдается слабовыраженный отек брюшины, отечный мезотелий встречается на небольшом протяжении, в соединительнотканной пластинке макрофаги и лимфоциты встречаются в единичном количестве.

При сравнении толщины брюшины отмечается статистически значимое увеличение как висцеральной, так и париетальной брюшины у животных, которым вводили гидрозоль наноалмазов (табл. 2).

Таблица 2

Толщина париетальной и висцеральной брюшины,  в мкм  (Me[Q1;Q3])

Толщина брюшины (мкм)

Группа животных

Введение 1мл 0,002 вес.% гидрозоля наноалмазов

Введение 1мл деионизованной воды

Контрольные (интактные) животные

Париетальная брюшина

12,37[8,32;15,71]

8,59[6,37;11,31]

р1<0,01

5,56[4,56;7,39]

р1=0,00

р2<0,01

Висцеральная брюшина

3,92[3,11;5,06]

3,15[2,70;3,88]

р1<0,01

1,86[1,51;2,25]

р1=0,00

р2=0,00

Примечание: р1 - уровень значимости «р» при сравнении с группой животных, которым вводили гидрозоль наноалмазов. р2 - уровень значимости «р» при сравнении с группой животных, которым вводили деионизованную воду.

Введение деионизованной воды также вызывает статистически значимое утолщение париетальной и висцеральной брюшины, но в гораздо меньшей степени, чем при введении наночастиц (табл.2).

Заключение

Обобщая полученные нами данные, можно сделать заключение о том, что, несмотря на высокую биологическую совместимость наноалмазов детонационного синтеза, введение данных наночастиц в виде стерильного гидрозоля концентрации 0,002 вес.%вызывает реакцию со стороны брюшины, проявляющуюся в виде ёё отека, инфильтрации клетками макрофагального и лимфоидного ряда, увеличении содержания перитонеальных макрофагов в состоянии терминального блеббинга и некроза в экссудате из полости брюшины. Увеличение процентного содержания перитонеальных макрофагов в состоянии терминального блеббинга и некроза происходит за счет уменьшения доли интактных клеток в выделенной клеточной популяции, в связи с чем происходит увеличение индекса блеббинга. Кроме этого, аналогичные реактивные изменения со стороны брюшины мы обнаружили и при введении в ее полость деионизованной воды, хотя и в гораздо меньшей степени. Следовательно, вполне закономерным является предположение, что реакция организма экспериментальных животных на введение гидрозоля наноалмазов в концентрации 0,002 вес.% складывается из двух факторов - наличия наночастиц и крайне низкого осмотическогодавлениядисперсионной среды (деионизованной воды). Таким образом, для уменьшения влияния золей наноалмазов детонационного синтеза на серозную оболочку брюшной полости и активацию перитонеальных макрофагов можно рекомендовать вводить интраперитонеально данные наночастицы в дисперсионной среде, имеющей осмотическое давление, приближенное к физиологическим показателям.

 

Авторы выражают искреннюю признательность и благодарность за помощь в проведении исследования заведующей кафедрой биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии КрасГМУ, д.м.н., проф. Салминой Алле Борисовне и профессору кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии КрасГМУ, д.м.н., Малиновской Наталии Александровне; за предоставление стерильных гидрозолей наноалмазов детонационного синтеза заведующему лабораторией нанобиотехнологии и биолюминесценции ИБФ КНЦ СО РАН (г.Красноярск), д.б.н. Бондарю Владимиру Станиславовичу, старшему научному сотруднику лаборатории нанобиотехнологии и биолюминесценции ИБФ КНЦ СО РАН (г.Красноярск) Пузырю Алексею Петровичу.

Рецензенты:

Али-Риза А.Э., д.м.н., профессор кафедры патологической анатомии им. проф. П.Г. Подзолкова с курсом ПО ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России, г. Красноярск;

Савченко А.А., д.м.н., профессор, руководитель лаборатории молекулярно-клеточной физиологии и патологии ФГБНУ «Научно-исследовательского института медицинских проблем Севера», г. Красноярск.


Библиографическая ссылка

Инжеваткин Е.В., Жуков Е.Л., Инжеваткин Е.В., Медведева Н.Н. РЕАКЦИЯ БРЮШИНЫ МЫШЕЙ ПРИ ИНТРАПЕРИТОНЕАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ ДЕТОНАЦИОННЫХ НАНОАЛМАЗОВ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 5.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=22339 (дата обращения: 29.09.2020).


Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074