Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,682

ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ГЛИКОПРОТЕИНА-Р ПРИ ХИРУРГИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИПОТИРЕОЗЕ

Щулькин А.В. 1 Якушева Е.Н. 1 Черных И.В. 1 Титов Д.С. 1 Попова Н.М. 1 Никифоров А.А. 1
1 Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
В исследовании на кроликах породы шиншилла изучено функционирование гликопротеина-Р (Pgp) при хирургическом экспериментальном гипотиреозе, моделируемом субтотальной резекцией щитовидной железы с оставлением паращитовидных желез. Функциональную активность Pgp определяли по фармакокинетике его маркерного субстрата – фексофенадина. Концентрацию фексофенадина в плазме крови кроликов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Уровни тиреоидных гормонов в сыворотке крови оценивали радиоиммунным методом. Установлено, что при хирургическом гипотиреозе максимальная концентрация фексофенадина (Сmax) и площадь под фармакокинетической кривой концентрация время (AUC0-t) увеличивались, общий клиренс (Cl) снижался. Выявлены корреляционные зависимости между уровнем ТТГ и Сmax, AUC0-t и Cl, концентрацией Т4 и Cmax/AUC0-t. Изменения параметров фармакокинетики фексофенадина свидетельствует о снижении функциональной активности Pgp при хирургическом экспериментальном гипотиреозе.
гликопротеин-Р
ABCB1 белок
функциональная активность
фексофенадин
субтотальный хирургический гипотиреоз
1. Разина А.В., Фролова А.И., Сергеев М.А. Оптимизация метода общей анестезии на кроликах // Актуал. вопросы ветер. биол. - 2010. - T. 1, № 5. - C. 32-35.
2. Якушева Е.Н., Щулькин А.В., Бирюкова А.С. Дозозависимое влияние тироксина на функциональную активность гликопротеина-Р в эксперименте // Биомедицина. - 2012. - № 2. - С. 53-60.
3. Mitin T. et al.Levothyroxine up-regulates P-glycoprotein independent of the pregnane X receptor // Drug Metab. Dispos. - 2004. - Vol. 32, № 8. - P. 779-782.
4. Scotto K.W., Johnson R.A. Transcription of MDR. A Therapeutic Target // Mol. Intervent. - 2001. - Vol. 1. - P. 117-125.
5. Sharom F.J. The P-glycoprotein multidrug transporter // Essays Biochem. - 2011. - Vol. 50, № 1. - P. 161–178.
6. Viguerie N., Langin D. Effect of thyroid hormone on gene expression // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. - 2003. - Vol. 6, № 4. - P. 377–381.
Гликопротеин-Р (Рgp) - АТФ-зависимый мембранный белок-транспортер (АВСВ1), обеспечивающий экскрецию липофильных эндогенных и экзогенных веществ из клетки. Локализуясь в эпителиоцитах кишечника, клетках печени, почек и эндотелиоцитах гистогематических барьеров, он играет важную роль в процессах всасывания, распределения и выведения лекарственных веществ, являющихся его субстратами [5].

Гормоны щитовидной железы оказывают множество эффектов на рост, развитие организма и обменные процессы. В исследованиях in vitro показано, что трийодтиронин (Т3) и тетрайодтиронин (Т4) стимулируют экспрессию Pgp [3]. На кроликах породы шиншилла выявлено, что тироксин дозозависимо повышает функциональную активность данного белка-транспортера на уровне целостного организма [2].

Целью настоящего исследования стала оценка функциональной активности Pgp при хирургическом экспериментальном гипотиреозе.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на 13 половозрелых кроликах-самках породы шиншилла, массой 3500-4300 г, находящихся в фазе диэструса, полученных из питомника ООО «Касимов-Миакро» и имеющих необходимые ветеринарные свидетельства. Экспериментальные исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (Приложение к приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 года 708н).

1-ю группу животных составили кролики, у которых оценивали функционирование Pgp после «ложной операции» (n=5); 2-ю группу - кролики, у которых определяли функциональную активность Pgp на фоне хирургического экспериментального гипотиреоза (n=8). «Ложная» операция заключалась во вскрытии кожных покровов и подкожной жировой клетчатки в проекции щитовидной железы с последующим послойным ушиванием раны. Хирургический экспериментальный гипотиреоз моделировали посредством субтотальной резекции щитовидной железы с оставлением паращитовидных желез. Оперативные вмешательства выполняли в условиях операционной после наркотизации животных введением рометара (ксилазина гидрохлорида) в дозе 4,0-6,0 мг/кг массы внутримышечно (в/м) с последующим (через 20 минут) в/м введением золетила-50 в дозе 5-10 мг/кг массы [1].

За 7 дней до операции, на 7-е, 14-е (животные 1-й и 2-й групп), 21-е и 28-е сутки после операции (животные 2-й группы) определяли функциональную активность Pgp по анализу фармакокинетики фексофенадина - маркерного субстрата данного белка-транспортера после его однократного перорального введения в дозе 30 мг/кг массы («Телфаст», SanofiAventis, Франция) [2] с последующим забором крови из краевой вены уха через 1; 2; 3; 4; 5; 6; 12 и 24 часа в гепаринизированные пробирки в объеме 5 мл.

Фексофенадин не подвергается метаболизму, и его фармакокинетика зависит исключительно от функционирования Pgp. Поэтому высокие концентрации фексофенадина в плазме крови кроликов и его медленное выведение свидетельствуют о низкой функциональной активности Pgp, и наоборот. Плазменные концентрации фексофенадина  определяли методом ВЭЖХ на хроматографе Beckman Coulter (США) с УФ-детектированием по оригинальной методике [2]. В ходе исследования оценивали следующие фармакокинетические параметры фексофенадина: Сmax - максимальная концентрация (нг/мл); AUC0-t - площадь под кривой «концентрация - время» от нуля до времени последнего забора крови (нг*ч/мл); Сl - общий клиренс (мл/мин); Сmax / AUC0-t -  коэффициент абсорбции.

У животных 2-й группы в указанные сроки также определяли уровни тиреоидных гормонов (ТТГ, общий Т3, общий Т4) в сыворотке крови радиоиммунным методом с использованием стандартных тест-систем производства IMMUNOTECH (Чехия) и дальнейшей оценкой результатов на анализаторе «Иммунотест» (Россия) в ЦНИЛ РязГМУ.

Полученные результаты обрабатывали с помощью программ StatSoft Statistica 7.0 и «Биостат». Характер распределения данных оценивали по критерию Шапиро-Уилка. Для сравнения показателей, имеющих нормальное распределение, использовали тест ANOVA повторных измерений, а при распределении признаков, отличном от нормального, - критерий Фридмана. Различия между сериями определяли по критерию Ньюмена-Кейсла. Для анализа корреляции между гормональным статусом кроликов и фармакокинетическими параметрами фексофенадина использовали коэффициент корреляции Спирмена. Данные в таблицах представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения среднего арифметического (M±SD) в случае их нормального распределения, и медианы, нижнего и верхнего квартилей (Med, lq, uq) - в случае отличного от нормального распределения.

Результаты исследования и их обсуждение

Выполнение ложной операции не оказало влияния на фармакокинетические параметры маркерного субстрата Pgp - фексофенадина - на 7-е и 14-е сутки после оперативного вмешательства, что свидетельствует о сохранении функциональной активности белка-транспортера на исходном уровне (табл. 1).

Таблица 1

Основные фармакокинетические параметры фексофенадина после выполнения «ложной операции» (n=5)

Изучаемые параметры

Исходные значения

7-е сутки после «ложной операции»

14-е сутки после «ложной операции»

Сmax, нг/мл

172,0 (95,7; 356,9)

139,3 (138,1; 173,4)

253,0 (164,7; 256,2)

AUC0-t, (нг/мл)×ч

746,4 (360,7; 1302,4)

1141,4 (627,7; 1224,9)

1750,7 (1634,6; 1793,3)

Cl, л/ч

396,7±408,9

294,8±211,4

102,4±61,6

Cmax/AUC0-t, 1/ч

0,21±0,11

0,20±0,10

0,08±0,05

* - p<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных животных (исходные значения).

Субтотальная резекция щитовидной железы приводила к развитию экспериментального гипотиреоза, о чем свидетельствуют изменения гормонального статуса кроликов (табл. 2). Концентрация ТТГ достоверно (p<0,05) повышалась на 7-е сутки эксперимента на 21,1%, на 14-е сутки - на 14,7%, на 21-е сутки - на 16,8%, на 28-е сутки - на 12,0%. Уровень Т3 снижался на 7-е и 14-е сутки послеоперационного периода на 45,4% (p<0,05) и 28,0% (p<0,05) соответственно, а в остальные сроки достоверно от исходных показателей не отличался. Содержание Т4 достоверно (p<0,05) уменьшалось на 7-е сутки на 45,6%, на 14-е сутки - на 26,1%, на 21-е сутки - на 21,7%, а на 28-е сутки - на 20,8%. Нормализация Т3 к 21-му дню исследования свидетельствует о регенерации щитовидной железы и восстановлении уровня, в первую очередь, наиболее активного гормона.

В таблице 2 представлены изменения фармакокинетики фексофенадина на фоне  хирургического гипотиреоза. На 7-е сутки эксперимента Сmax фексофенадина увеличивалась на 121,7% (p<0,05), AUC0-t - на 231,3% (p<0,05), Cl уменьшался на 66,9% (p<0,05) по сравнению с исходными значениями. На 14-е сутки экспериментальной патологии Сmax фексофенадина увеличивалась на 99,4% (p<0,05), AUC0-t - на 218,9% (p<0,05), Cl уменьшался на 66,5% (p<0,05). На 21-е сутки исследования Сmax фексофенадина превышала исходные показатели на 137,8% (p<0,05), AUC0-t - на 308,6% (p<0,05), Cl был снижен на 75,0% (p<0,05). На 28-е сутки патологии Сmax фексофенадина оставалась повышенной на 189,5% (p<0,05), AUC0-t - на 247,6% (p<0,05) по сравнению со значениями интактных кроликов, Cl снижался на 66,7% (p<0,05). На протяжении всего исследования отношение Cmax/AUC0-t - показатель, характеризующий всасывание фексофенадина в кишечнике -достоверно по сравнению с показателями интактных животных не изменялось (p>0,05).

Таблица 2

Основные фармакокинетические параметры фексофенадина и гормональный статус кроликов на фоне хирургического экспериментального гипотиреоза (n=8)

Изучаемые параметры

Исходные значения

Сутки после субтотальной резекции щитовидной железы

7-е сутки

14-е сутки

21-е сутки

28-е сутки

Сmax, нг/мл

119,6 (94,2; 175,3)

265,1 (153,7; 404,5)*

238,5 (187,7; 412,5)*

284,4 (200,1; 467,0)*

346,3 (175,2; 486, 2)*

AUC0-t, (нг/мл)×ч

829,9 (459,1; 1270,2)

2749,7 (1707,3; 4020,3)*

2647,3 (1426,0; 3297,4)*

3391,2 (2127,5; 4763,3)*

2884,6 (1535,9; 5347,6)*

Cl, л/ч

72,0 (36,8; 128,8)

23,8 (12,9; 40,7)*

24,1 (14,4; 52,8)*

18,0 (11,7; 36,4)*

24,0 (8,9; 42,9)*

Cmax/AUC0-t, 1/ч

0,14 (0,12; 0,22)

0,09 (0,09; 0,12)

0,12 (0,07; 0,20)

0,09 (0,08; 0,12)

0,12 (0,08; 0,14)

ТТГ, мМЕ/л

0,95±0,145

1,15±0,09*

1,09±0,064*

1,11±0,045*

1,08±0,04*

Общий Т3, нмоль/л.

9,52±1,174

5,20±1,574*

6,85±1,818*

8,48±1,219

8,18±1,440

Общий Т4, нмоль/л

13,99±2,497

7,61±3,039*

10,34±2,352*

10,96±1,735*

11,08±1,612*

* - p<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных животных (исходные значения).

При проведении корреляционного анализа были выявлены достоверные зависимости между концентрацией ТТГ и Сmax (R=0,39, p=0,012), ТТГ и AUC0-t (R=0,525, p=0,0005), ТТГ и Cl (R=-0,46, p=0,003), уровнем Т4  и Cmax/AUC0-t, (R=0,38, p=0,016).

Динамика параметров фармакокинетики фексофенадина - маркерного субстрата Pgp - указывает на более высокое содержание препарата в плазме крови у животных на фоне хирургического экспериментального гипотиреоза, что, в свою очередь, характеризует уменьшение функциональной активности белка-транспортера на организменном уровне. При проведении «ложной операции» функциональная активность Pgp оставалась на исходном уровне, что является подтверждением того, что изменение функционирования белка-транспортера связано именно с резекцией щитовидной железы.

Молекулярные механизмы изменения функционирования Рgp в настоящее время активно изучаются. Ведущую роль в данном процессе играет уровень экспрессии гена MDR1, кодирующего данный белок-транспортер.

Его повышенная экспрессия в нормальных и трансформированных клетках инициируется сигналами от большого количества стимулов, которые сходятся на общей области промотора гена MDR1, называемой «MDR1 enhanceosome» [4].

Тиреоидные гормоны могут повышать экспрессию Pgp, непосредственно взаимодействуя с промотором гена MDR1 или опосредованно, через прегнан-Х-рецептор [3]. Большинство эффектов гормонов щитовидной железы реализуется в результате их взаимодействия со специфическими ядерными рецепторами, которые всегда связаны с участками ДНК - «тиреоидчувствительными элементами» (thyroid response elements). В отсутствие гормонов соответствующие рецепторы ингибируют экспрессию генов, в присутствии тиреиодных гормонов блок снимается [6].

Выявленная в исследовании корреляционная зависимость между содержанием ТТГ  - Сmax, AUC0-t и Cl при отсутствии достоверных связей с концентрациями Т3 и Т4 свидетельствует о том, что функционирование Pgp при хирургическом гипотиреозе зависит не столько от уровня тиреоидных гормонов, сколько от факта их дефицита, показателем которого является в первую очередь концентрация ТТГ.

Выводы

Таким образом, в настоящем исследовании установлено, что при хирургическом экспериментальном гипотиреозе у кроликов происходит снижение функциональной активности гликопротеина-Р на уровне целостного организма, определяемой по фармакокинетике его маркерного субстрата - фексофенадина.

Рецензенты:

Ших Е.В., д.м.н., профессор, директор Института профессионального образования ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, г. Москва;

Покровский М.В., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой фармакологии ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Министерства образования и науки Российской Федерации, г. Белгород.


Библиографическая ссылка

Щулькин А.В., Якушева Е.Н., Черных И.В., Титов Д.С., Попова Н.М., Никифоров А.А. ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ГЛИКОПРОТЕИНА-Р ПРИ ХИРУРГИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИПОТИРЕОЗЕ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 5.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=22146 (дата обращения: 17.12.2018).


Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252