Материалы и методы
В работе были использованы 22 самца крыс линии Вистар массой 200-220 г. Исследования проводили в соответствии с международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals». Индивидуальную эмоциональную реактивность крыс определяли в тесте "открытое поле" с расчетом индекса двигательной активности (ИА) как отношения суммы пересеченных периферических и центральных секторов к сумме латентных периодов первого движения и выхода в центр. К прогностически устойчивым к стрессу (активным) особям были отнесены 9 животных со значением ИА более 1.5, к предрасположенным (пассивным) - 10 крыс с ИА менее 0.8 [1]. Была также определена группа из 3 амбивалентных крыс со средними значениями коэффициента - от 0.8 до 1.5.
Забор ЦСЖ осуществляли под анестезией хлоралгидратом из большой цистерны головного мозга двукратно с интервалом в 10 дней по известной методике [2]. При этом вторую пункцию проводили после иммобилизационного ЭС (фиксация за четыре конечности в течение 2.5 часов). ЦСЖ доводили физиологическим раствором до объема 400 мкл, а затем проводили выделение вкДНК фенольным методом. Концентрацию вкДНК определяли на флуориметре EnspireTM 2300 (Perkin Elmer) по флуоресценции Picogreen (Invitrogen, США) при длинах волн возбуждения 480 нм и эмиссии 520 нм. Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью программного пакета Statistica 6.0 . Для проверки гипотезы о различии независимых выборок использовали U-тест Манна-Уитни. Результаты представляли в виде медианы значений и межквартильного интервала Ме [25%; 75%]. Для исследования связи признаков использовали непараметрический анализ по Спирмену.
Результаты исследования
В таблице 1 представлены медианы концентраций вкДНК в ликворе предрасположенных, устойчивых к стрессу и амбивалентных животных. Они составили 27, 68 и 20 нг/мл соответственно (табл. 1). В группе устойчивых к стрессу животных наблюдалась тенденция к большему уровню вкДНК по сравнению с остальными двумя. Объем ликвора, который в норме удавалось отобрать, был примерно одинаков для всех групп животных.
Таблица 1
Уровень вкДНК и объем ликвора в большой цистерне мозга у крыс с различной эмоциональной резистентностью в норме и ЭС
|
|
Группы животных |
|||||
|
предрасположенные к стрессу n=10 |
устойчивые к стрессу n=9 |
амбивалентные n=3 |
||||
|
контроль |
стресс |
контроль |
стресс |
контроль |
стресс |
|
|
концентрация вкДНК, нг/мл |
27 [23;56] |
32 [24;73] |
68 [25;80] |
46 [28;60] |
20 [20;22] |
23 [23;26] |
|
объем ЦСЖ, мкл |
86 [81;90] |
86 [81;87] |
88 [76;89] |
84 [78;139] |
93 [93;107] |
91 [74;100] |
|
общее количество ДНК в пробе, нг |
2.1 [2.0;6.3] |
2.7 [2.0;6.4] |
6.1 [2.2;6.5] |
6.2 [2.1;6.8] |
2.1 [1.9;2.1] |
2.1 [1.9;2.3] |
Медианы концентраций вкДНК в ликворе предрасположенных, устойчивых к стрессу и амбивалентных животных после иммобилизационного стресса составили 32, 46 и 23 нг/мл соответственно. Как следует из оценки соответствующих верхних границ межквартильных интервалов, после ЭС концентрация вкДНК в ЦСЖ устойчивых к стрессу животных демонстрировала тенденцию к снижению, а у предрасположенных - наоборот, к повышению.
Рис. 1. Концентрация вкДНК в ЦСЖ у крыс до и после ЭС. Черные столбики- активные животные, серые-пассивные
Рис. 2. Объемы аликвот отобранного ликвора у крыс до и после ЭС. Черные столбики- активные животные, серые-пассивные
После стрессорной нагрузки изменения содержания вкДНК были выявлены у 5 из 9 устойчивых к эмоциональному стрессу животных (рис.1). При этом у 4 крыс уменьшение концентрации вкДНК сопровождалось увеличением объема аликвот отбираемого ликвора. У 5-ой активной особи концентрация вкДНК увеличивалась, а объем ЦСЖ снижался. Среди пассивных животных изменения концентрации вкДНК в ЦСЖ после стрессорной нагрузки были выявлены у 6 животных из 10: у четырех из них увеличение концентрации вкДНК сопровождалось снижением объема ликвора, у двух наблюдалось уменьшение концентрации вкДНК, причем в одном случае объем ликвора после стресса возрастал, а в другом - не изменялся. У амбивалентных животных концентрация и объем отбираемого ликвора до и после ЭС оставалась на том же уровне.
Как в группе устойчивых, так и в группе предрасположенных к ЭС животных, нами была выявлена обратная корреляционная зависимость между изменением объема аликвот ликвора, которые удавалось отобрать до и после ЭС, и изменением концентрации вкДНК в данных аликвотах. Коэффициент корреляции Спирмена (R) составил -0.73 и -0.78 при р<0.05 для предрасположенных (n=10) и устойчивых (n=9) животных соответственно.
Интересно отметить, что все изучаемые животные как в норме, так и после ЭС статистически достоверно (р<0.005, U-тест) разделялись на 2 группы - с повышенным 6.5 [6.2;7] (n=9) и низким 2.1 [2;2.1] (n=13) общим количеством вкДНК (в нг) в пробе. При этом в контрольной группе среди устойчивых к ЭС крыс всего 33% животных имели низкое количество вкДНК в ЦСЖ, в то время, как доля таких животных среди предрасположенных к стрессу составила 70% (рис.1). Низкое количество вкДНК в ЦСЖ было обнаружено и у всех изучаемых амбивалентных животных. После ЭС эта закономерность сохранялась. В группе устойчивых к стрессу крыс общее количество вкДНК в пробе оставалось постоянным до и после ЭС у 8-ми из 9 животных. Среди предрасположенных к стрессу животных постоянство общего количества вкДНК было отмечено у 8 из 10 животных (рис. 1).
Обсуждение результатов
По общему количеству ДНК в образцах все животные статистически достоверно разделялись на 2 группы - с низким и высоким общим количеством вкДНК в ЦСЖ. Причем, в группе устойчивых к стрессу животных преобладали особи с высоким общим количеством вкДНК в ликворе, а среди предрасположенных и амбивалентных к стрессу - наоборот, с низким.
Выявленная нами тенденция к большему уровню вкДНК у группы устойчивых к стрессу животных согласуется с результатами, полученными ранее при исследовании вкДНК в плазме крови крыс с разной индивидуальной эмоциональной устойчивостью [7]. Концентрация вкДНК в плазме крови устойчивых к стрессу животных также превышала таковую у предрасположенных, но в крови это различие было выражено более явно. Поскольку определение концентрации вкДНК в плазме крови крыс проводилось тем же методом, что и в данном исследовании, интересным представлялось провести сравнительную оценку концентраций вкДНК в крови и ЦСЖ в норме у крыс с различной эмоциональной резистентностью. Значения концентраций вкДНК в плазме крови предрасположенных и устойчивых к стрессу животных составили соответственно 60[52;69] (n=17) и 155[134;174] (n=11) нг/мл. Очевидно, что концентрация вкДНК в ЦСЖ крыс была ниже, чем в плазме крови в 2.1 и 3.0 раза для предрасположенных и устойчивых к стрессу животных соответственно. Рассчитанные соотношения имеют один порядок с ранее полученными результатами на людях - концентрация вкДНК в ЦСЖ пациентов с болезнью Паркинсона оказалась в 3.3 ниже, чем в плазме крови.
Источниками вкДНК, циркулирующей в биологических жидкостях, являются некротические и апоптотические клетки, а также процессы активной секреции из жизнеспособных клеток [10]. Известно, что ЭС индуцирует неспецифический окислительный стресс (ОС) в организме, сопровождающийся массовой гибелью клеток, что в свою очередь приводит к изменению концентрации и свойств вкДНК, циркулирующей в крови. В мозге стрессовые воздействия индуцируют эксайтотоксичность и нейровоспаления, также приводящие к клеточной гибели, а, следовательно, к выбросу вкДНК в экстраклеточное пространство. Кроме того, ранее в работе Строуна и Анкера была показана возможность проникновения вкДНК в мозг через гематоэнцефалический барьер [5]. Поэтому, в данной работе нам представлялось интересным проверить, происходят ли изменения концентрации вкДНК, циркулирующей в ЦСЖ при ЭС.
Мы не выявили статистически достоверных изменений концентрации вкДНК в ЦСЖ после ЭС, индуцированного 2.5ч иммобилизацией за 4 конечности, в группах предрасположенных, устойчивых и амбивалентных к стрессу животных. Также не удалось установить связь между резистентностью животных к ЭС и изменением концентрации вкДНК в ЦСЖ после стресса. Полученный нами результат может быть объяснен несколькими причинами. Возможно, значительное изменение уровня вкДНК в ЦСЖ происходит лишь в случае развития хронических патологий мозга - болезней Паркинсона, Альцгеймера, злокачественных новообразований. Острые расстройства, такие как ЭС, могут не вызывать существенных изменений, поскольку вкДНК, выделяемая при гибели клеток мозга, может поглощаться соседними клетками и расщепляться внеклеточными эндонуклеазами, не успевая попасть в желудочки. Другими возможными причинами отсутствия достоверных различий могут служить малый объем выборок животных, сравнительно небольшая длительность стрессорного воздействия, а также наложение процессов расщепления, появления свежей вкДНК в ЦСЖ и изменения скорости локального мозгового кровотока после стресса.
Содержание вкДНК в ЦСЖ отдельных крыс в пределах групп предрасположенных и устойчивых к стрессу животных изменялось не одинаково. Данный факт может быть связан с тем, что тестирование поведения в открытом поле позволяет лишь прогностически оценить степень устойчивости к стрессорным нагрузкам, которая наиболее ярко проявляется в популяционной совокупности животных. При этом индивидуальная устойчивость отдельной особи в группе устойчивых или предрасположенных может варьировать в широких пределах.
Полученный нами результат свидетельствует о том, что вкДНК, циркулирующая в биологических жидкостях, в перспективе может быть использована в качестве уникального показателя предрасположенности животного к стрессорным воздействиям.
Выявленная нами обратная корреляционная зависимость между изменениями объема аликвот ликвора и концентрации в них вкДНК при ЭС как у предрасположенных, так и у устойчивых к стрессу животных, при сохранении общего количества вкДНК в пробе постоянным может свидетельствовать существовании неизвестного механизма регуляции уровня вкДНК в желудочках мозга. Он может являться одной из форм адаптации организма и, в частности, мозга к стрессовым воздействиям. В настоящее время неясно, несет ли выявленный нами феномен постоянства общего количества вкДНК в аликвотах ликвора какую-либо физиологическую функцию. Для ответа на этот вопрос необходимы дальнейшие исследования.
Заключение
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что среди устойчивых крыс преобладают особи с высоким уровнем вкДНК в ликворе, среди предрасположенных и амбивалентных - с низким. При ЭС у устойчивых и предрасположенных к стрессу крыс происходят изменения объема отбираемых аликвот ликвора и уровня вкДНК в них и, возможно, активируются механизмы, препятствующие изменению общего количества ДНК в ликворе. Выявленные нами закономерности могут являться частью механизма адаптации мозга к стрессорным воздействиям и требуют дальнейшего более тщательного исследования [3]. Данные, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о перспективности исследования вкДНК в ЦСЖ животных с различной эмоциональной резистентностью и позволяют надеяться, что вкДНК, циркулирующая в биологических жидкостях, в перспективе может быть использована в качестве уникального показателя предрасположенности животных к стрессорным воздействиям.
Рецензенты:
Вагин Ю.Е., д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, г.Москва.
Джебраилова Т.Д., д.б.н., профессор кафедры нормальной физиологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, г.Москва.
Библиографическая ссылка
Умрюхин П.Е., Умрюхин П.Е., Григорчук О.С., Григорчук О.С. ВЛИЯНИЕ ЭМОЦИОНАЛЬНОЙ НАГРУЗКИ НА ОБЪЕМ ЛИКВОРА И СОДЕРЖАНИЕ В НЕМ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК У КРЫС // Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 5. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=14810 (дата обращения: 19.04.2024).