Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,006

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА БЕЛКА В ПРЕПАРАТАХ ИММУНОГЛОБУЛИНА

Миняева О.А. 1 Симонян Е.В. 1 Евсельева Е.А. 1 Позднякова Е.С. 1 Музафарова А.Р. 1 Саедгалина О.Т. 1
1 ГБОУ ВПО Южно-Уральский государственный медицинский университет
Изучены коллигативные и вязкостные свойства белковых препаратов на примере иммуноглобулина нормального и иммуноглобулина противоклещевого. Определены константы, входящие в уравнение Галлера. Установлен линейный характер зависимости понижения температуры замерзания от концентрации иммуноглобулинов, что позволяет рекомендовать метод осмометрии как экспрессный и точный метод определения концентрации белков в лекарственных препаратах. Показано, что в диапазоне концентраций белков 5-6% происходит переход сферической глобулярной конформации в эллиптическую глобулярную. Проявление анизодиаметричности белковых глобул приводит к отклонениям от правила Вант-Гоффа и уравнения Эйнштейна. Обосновано количественное определение содержания индивидуальных белков в препаратах по методу Лоури. Дана валидационная оценка предлагаемого спектрофотометрического метода и показано его соответствие критериям приемлемости.
сферическая и эллиптическая глобулярная конформация.
метод Лоури
вискозиметрия
осмометрия
иммуноглобулин
1. Государственная фармакопея Республики Беларусь. – Т. 1. Общие методы контроля каче-ства лекарственных средств. – Минск, 2006. – 656с.
2. Государственная фармакопея Российской Федерации XII издание. – Часть I / Издательство «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», 2008. – 704с.
3. Евсельева Е.А., Симонян Е.В., Миняева О.А. Определение молекулярных параметров и коллигативных свойств водных растворов альбумина // Современные проблемы науки и об-разования. – 2013. - № 6; URL: www.science-education.ru/113-11446 (дата обращения: 04.01.2014).
4. Поляк Р., Кату Р. Иммуноглобулины / под ред. Г. Литмена, Р. Гуда. – М.: «Мир», 2001. – 495 с.
5. Физическая и коллоидная химия: учеб. для фармац. вузов и факультетов / под ред. проф. Беляева А.П. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008 г. – 700 с.
6. Шульц Г., Ширмер Р. Принципы структурной организации белков. / Под ред. Е.М. Попова. – М.: «Мир», 1999. – 355 с.

Введение

Глобулины составляют около 40% всех белков сыворотки крови человека и содержат в своём составе от 14 до 19 L-аминокислот, среди них в больших количествах – лейцин, валин, лизин, глутаминовую кислоту, серин и треонин. Глобулины находятся в живом организме в форме биокомплексных соединений с липидами, углеводами и другими небелковыми веществами и выполняют транспортную, защитную и гормональную функции: переносят гормоны, витамины и другие вещества; защищают организм от вирусов, бактерий, токсинов, чужеродных белков, вырабатывая на них антитела; регулируют свертываемость крови; связывают половые гормоны, лекарства, углеводы и другие вещества [4]. Лекарственные препараты на основе глобулинов очень широко применяются в медицине ввиду жизненно важных функций данных белков в организме и возможности осуществлять эффективную терапию препаратами глобулинов. При этом к растворам для инъекций и инфузий предъявляются серьезные требования по изотоничности и изовязкости данных лекарственных форм крови человека.

Проблема определения концентрации белка в препаратах насчитывает уже более 60 лет. Очевидно, что создание «идеального метода» неосуществимо в силу уникальности структуры каждого белка. Спектрофотометрический метод определения – метод Лоури – обладает высокой чувствительностью (10-60 мг/л), но интенсивность окраски пропорциональна не концентрации общего белка, а количеству тирозина и триптофана. Содержание этих аминокислот в различных белках различно. Так, в альбуминах и γ-глобулинах оно различается более чем на 20%. Поэтому метод Лоури широкого применения в медико-биологической практике не нашел, хотя при определении концентрации индивидуальных белков он один из лучших.

В связи с этим целью данного исследования являлось изучение коллигативных и вязкостных свойств водных растворов иммуноглобулина противоклещевого и иммуноглобулина нормального на примере осмотического давления, понижения температуры замерзания и кинематической вязкости, а также обоснование использования метода Лоури для контроля качества белковых препаратов.

Материалы и методы исследования

В качестве объекта исследования использовали раствор иммуноглобулина нормального с концентрацией 10%, произведенный на Челябинской станции переливания крови, и раствор иммуноглобулина противоклещевого с концентрацией 10%, ОАО «Синтез», г. Курган. Определение температуры замерзания, эффективной осмотической концентрации и осмотического давления проводили на автоматическом криоскопическом осмометре ОМТ–5–02 [1, 2]. Испытуемые растворы иммуноглобулина объемом 0,2 мл помещали в кювету прибора, погруженную в термостат с контролируемой температурой, и замораживали. Осмолярность раствора автоматически определяется прибором по зафиксированной температуре замерзания. Для определения вязкости раствора альбумина для инфузий использовали капиллярный вискозиметр серии ВПЖ с диаметром капилляра 0,54 мм (константа капилляра ).

Количественное определение белка проводили по методу Лоури без предварительного осаждения белка [2]. Продукт взаимодействия иммуноглобулина с реактивом Фолина характеризуется максимумами светопоглощения при 330±2, 345±2 и 750±2 нм. Для построения калибровочного графика в мерную колбу вместимостью 25 мл вносили соответственно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 … 1 мл раствора стандартного образца предприятия, прибавляли по 5 мл реактива Фолина, доводили водой до метки, выдерживали 30 минут и измеряли оптическую плотность полученных растворов при выбранных длинах волн.

Результаты и их обсуждение

Известно, что изменение конформации белковой глобулы в целом приводит к изменению функциональной активности белка. В [3] было доказано, что молекулы альбумина в водных растворах с концентрацией до 10% находятся в виде сферических глобул. Глобулины по сравнению с альбуминами имеют более высокую молекулярную массу и также относятся к глобулярным белкам. С другой стороны, известно [6], что белковая глобула может иметь форму сферы и форму эллипса, причем форма эллипса характерна для белков с высокой молекулярной массой. Появление анизодиаметричности белковых глобул должно отразиться на коллигативных и вязкостных свойствах белковых препаратов.

Осмотическое давление в растворах белков описывается уравнением Галлера , где b – константа, учитывающая гибкость и форму макромолекул. При концентрациях ниже 1%, когда , и в случае сферической глобулярной структуры макромолекул вещества в растворе (b = 0) уравнение Галлера переходит в уравнение Вант-Гоффа [5]. В [3] было показано, что коллигативные свойства растворов альбумина (понижение температуры замерзания и осмотическое давление) линейно зависят от процентного содержания белка в растворе. Проведенные эксперименты с растворами иммуноголобулина нормального и иммуноглобулина противоклещевого позволили выявить ряд существенных отличий. Анализ зависимостей эффективной осмотической концентрации от процентной концентрации иммуноглобулинов показывает, что в интервале концентраций 5-6% наблюдается перегиб, и эффективная осмотическая концентрация белков в растворе начинает возрастать быстрее. Соответственно, в указанном интервале концентраций формируется перегиб на графиках зависимости осмотического давления от процентного содержания белка (рис. 1). Аппроксимация данных для осмотического давления полиномом второй степени позволяет определить значения постоянной b, входящей в уравнение Галлера: для иммуноглобулина нормального b1 = 5,0, для иммуноглобулина противоклещевого b2 = 15,3.

Рис. 1.

Зависимость осмотического давления от процентного содержания белка в растворе (кривая 1 – для иммуноглобулина нормального; кривая 2 – для иммуноглобулина противоклещевого)

Наличие перегиба на графиках рис. 1 свидетельствует о перестройке структуры белков в водных растворах. Для проверки данного утверждения провели пересчет экспериментальных данных и построили зависимости (рис. 2).

Рис. 2.

Зависимость отношения от содержания белков в водном растворе

(кривая 1 (участки 1-1 и 1-2) – иммуноглобулин нормальный,

кривая 2 (участки 2-1 и 2-2) – иммуноглобулин противоклещевой)

На зависимостях также обнаруживается излом в диапазоне концентраций белков 5-6%. Практически горизонтальные участки 1-1 и 2-1 в диапазоне концентраций иммуноглобулинов 0-5% свидетельствуют о том, что молекулы белков в водных растворах данных концентраций находятся в виде сферических глобул. При концентрациях белков свыше 6% отношение перестает быть постоянным, и участки графиков 1-2 и 2-2 отклоняются от горизонтали. Это является прямым доказательством того, что при концентрациях свыше 6% происходят изменения конформации белковых макромолекул иммуноглобулинов. Можно предположить, что нарушаются пропорции сферической формы, и глобулярная сферическая конформация переходит в глобулярную эллиптическую.

Линейный характер изменения кинематической вязкости раствора альбумина от содержания белка (рис. 3) дает основание говорить о применимости уравнения Эйнштейна к растворам альбумина с концентрацией, не превышающей 10%. Для нормального иммуноглобулина вязкость выше, чем для альбумина и, начиная с 6%-ного раствора, возрастает быстрее с ростом концентрации, чем это определено по линейному закону (рис. 3). Это подтверждает гипотезу о переходе сферической глобулярной структуры молекул иммуноглобулина нормального в эллиптическую глобулярную. Появление анизодиаметричности глобул приводит к искажению линейной зависимости кинематической вязкости растворов от концентрации белка.

Рис.3.

Зависимость кинематической вязкости растворов от процентного содержания белка

(кривая 1 – для альбумина; кривая 2 – для иммуноглобулина нормального).

Понижение температуры замерзания растворов иммуноглобулинов линейно зависит от процентной концентрации белков в растворах (таблица 1) аналогично зависимости, выявленной для альбумина [3].

Как следует из полученных данных, значения коэффициентов корреляции отвечают критерию приемлемости (не ниже 0,99 по модулю). В этом случае для количественного определения содержания иммуноглобулина нормального и иммуноглобулина противоклещевого в водных растворах и контроля качества препаратов может быть использован метод осмометрии.

Таблица 1.

Результаты линейного регрессионного анализа зависимостей понижения температуры замерзания раствора от концентрации иммуноглобулинов

Результаты метрологической обработки

Иммуноглобулин

нормальный

Иммуноглобулин противоклещевой

Уравнение регрессии вида

Погрешности

в определении параметров a и b

Коэффициент корреляции

Растворы иммуноглобулинов с концентрацией 10% не являются изотоничными плазме и крови человека в отличие от 10%-ного раствора альбумина [3] (эффективная осмотическая концентрация составляет соответственно 970 мосмоль/кг и 550 мосмоль/кг).

При определении количественного содержания иммуноглобулина нормального методом Лоури в интервале концентраций 0,04-0,2% наблюдается линейная зависимость оптической плотности растворов от концентрации белка в максимумах светопоглощения при 345±2 и 750±2 нм. Полученные данные полностью соответствуют критерию приемлемости линейности методики (R2 = 0,9921 при аналитической длине волны 750 нм). Определение количественного содержания белка и валидационную оценку метода проводили по стандартному образцу (таблица 2). Правильность методики устанавливали путем измерения количественного содержания белка в растворах, полученных путем добавления определенного количества стандарта к исследуемому раствору (таблица 3).

По результатам определения метод Лоури отличается воспроизводимостью и небольшой погрешностью определения, что дает основание использовать его при количественной оценке содержания белка в лекарственных формах.

Среднее значение открываемости для иммуноглобулина составило 98,45 %. Согласно критерию приемлемости средний процент восстановления при использовании растворов заданных концентраций, скорректированный на 100%, и его средняя величина должны находиться в пределах 100 ± 5 %. Рекомендуемая методика определения содержания иммуноглобулина нормального по методу Лоури соответствует критерию приемлемости.

Таблица 2

Результаты количественного определения иммуноглобулина нормального методом Лоури

Найдено белка, %

Xi - Xср

(Xi - Xср)2

Метрологические характеристики

9,98

- 0,1

0,01

Xср =10,08 %

SD = 0,10517

x±∆x = 10,1±0,1

RSD = 1%

 

 

10,13

0,05

0,0025

10,14

0,06

0,0036

9,92

- 0,16

0,0256

10,18

0,1

0,01

10,14

0,06

0,0036

Таблица 3

Определение правильности методики количественного определения иммуноглобулина нормального методом Лоури

Содержание белка в исследуемом растворе, г

Добавлено стандартного образца белка, г

Расчетное содержание белка, г

Найденное содержание, г

Открываемость белка, %

0,1008

0,25

0,3508

0,3458

98,57

0,1008

0,25

0,3508

0,3396

96,81

0,1008

0,25

0,3508

0,3424

97,61

0,1008

0,5

0,6008

0,5916

98,47

0,1008

0,5

0,6008

0,5954

99,10

0,1008

0,5

0,6008

0,5894

98,10

0,1008

0,75

0,8508

0,8423

99,00

0,1008

0,75

0,8508

0,8462

99,45

0,1008

0,75

0,8508

0,8397

99,00

Среднее значение открываемости

98,45

Выводы

1. Обосновано применение метода Лоури как высокочувствительного спектрофотометрического метода количественного определения содержания индивидуальных белков.

2. Для контроля содержания белка в препаратах иммуноглобулина возможно применение криоскопического метода, поскольку доказана линейная зависимость понижения температуры замерзания раствора от процентного содержания белка, имеется аппаратурная база, а сам метод является экспрессным и требующим достаточно малых количеств препарата для определения.

3. Детальное изучение коллигативных свойств водных растворов иммуноглобулина противоклещевого и иммуноглобулина нормального дало возможность выявить область концентраций (5-6%), в которой происходит переход глобулярной сферической конформации глобулярную эллиптическую. С появлением анизодиаметричности частиц увеличение %-ного содержания белка приводит к более быстрому росту эффективной осмотической концентрации и осмотического давления.

Рецензенты:

Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биохимии, ГБОУ ВПО Южно-Уральский государственный медицинский университет, г. Челябинск.

Колесников О.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой биологии, ГБОУ ВПО Южно-Уральский государственный медицинский университет, г. Челябинск.


Библиографическая ссылка

Миняева О.А., Симонян Е.В., Евсельева Е.А., Позднякова Е.С., Музафарова А.Р., Саедгалина О.Т. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА БЕЛКА В ПРЕПАРАТАХ ИММУНОГЛОБУЛИНА // Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 1. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=11904 (дата обращения: 19.03.2024).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1,674