Листья подорожника большого (Folia Plantaginis majoris) – официнальное лекарственное растительное сырье, используемое как лекарственное средство отхаркивающего действия в виде настоя [1]. Достоинствами настоев является индивидуальность назначения и лечения для каждого конкретного пациента. Сорокиной С. А. с соавторами при разработке Проекта фармакопейной статьи «Настои» для Государственной Фармакопеи (ГФ) XII издания предложено проведение качественного и количественного анализа настоев [7], что соответствует международным требованиям стандартизации и является гарантией эффективности и безопасности применения.
Сотрудниками ПГФА было проведено фармакогностическое исследование листьев подорожника большого и фитопрепаратов, разработан Проект фармакопейной статьи для Государственной Фармакопеи (ГФ) XII издания, показано, что листья подорожника среднего (Plantago media L.) и подорожника ланцетного (Plantago lanceolata L.) по качественному и количественному содержанию флавоноидов и полисахаридов близки к официнальному сырью [8, 9, 10]. Флавоноиды как группа биологически активных веществ обладают слабым антимикробным действием, полисахариды усиливают это действие [3], и в то же время полисахариды могут быть объектом микробной контаминации, что необходимо учитывать при лечении заболеваний верхних дыхательных путей. Флавоноиды и полисахариды составляют водорастворимую фракцию суммы биологически активных веществ листьев подорожника, поэтому количественная оценка их содержания и изучение антимикробной активности настоев этих растений является актуальным.
Целью данной работы является фитохимический и микробиологический анализ настоев листьев подорожника большого и оценка возможности использования листьев подорожника среднего и подорожника ланцетного наравне с лекарственным сырьем подорожника большого для изготовления настоев.
Материал и методы. Объекты исследования – настои, которые готовили в соотношении 1:10 по методике статьи «Настои» проекта ГФ XII издания [7] из листьев подорожника большого, подорожника среднего и подорожника ланцетного, заготовленных в Пермском крае согласно «Инструкции по заготовке…» [6].
В настоях определили присутствие полисахаридов и флавоноидов качественными реакциями [2], органолептические показатели и pH (по универсальной индикаторной бумаге), содержание окисляемых (дубильных) веществ, сухого остатка и одной из основных групп биологически активных веществ – суммы флавоноидов [7].
Анализ исходного сырья для приготовления настоев проводили по содержанию полисахаридов гравиметрическим методом [1] по модифицированной методике [10]; суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид – методом дифференциальной спектрофотометрии, используя реакцию комплексообразования с алюминия хлоридом, на СФ-2000 при длине волны 385 нм [8, 10]; суммы окисляемых (дубильных) веществ – по методике ГФ XI издания [1].
В качестве биологических тестов использовали 24-часовые культуры Staphylococcus aureus, Escherichia coli, а также 48-часовую культуру Candida albicans; в качестве среды – мясопептонный бульон и жидкую среду Сабуро для Candida albicans. Концентрация культуры при определении антимикробной активности составила 104 микробных клеток. Исследование проводили методом серийных разведений. Контроль за размножением бактерий осуществляли визуально и посевом на плотные питательные среды Staphylococcus aureus, Escherichia coli через 24 ч, а Candida albicans через 48 ч. Бактериостатическое и бактерицидное действие оценивали по минимальной подавляющей концентрации и росту микроорганизмов на плотных питательных средах [2].
Результаты исследования и обсуждение
Исходные образцы листьев подорожника большого, используемые для получения настоя, соответствовали требованиям ГФ ХI издания, вып.2 [2]. Показатели содержания флавоноидов в образцах официнального сырья и в листьях подорожника среднего и подорожника ланцетного близки между собой, что согласуется с ранее проведенными исследованиями [8, 10]. Результаты анализа исходных образцов листьев трех видов рода Plantago L. представлены в табл. 1.
Таблица 1
Содержание биологически активных веществ в листьях различных видов рода Plantago L.
|
Наименование показателей |
Номер образца |
Подорожник большой |
Подорожник средний |
Подорожник ланцетный |
|
Содержание флавоноидов в пересчете на цинарозид, % |
1 2 3 |
0,85±0,03 0,70±0,03 1,02±0,01 |
0,84±0,01 0,58±0,02 1,12±0,03 |
1,07±0,02 0,54±0,02 0,85±0,03 |
|
Содержание суммы окисляемых (дубильных) веществ, % |
1 2 3 |
4,23±0,04 3,80±0,10 5,95±0,04 |
6,41±0,09 5,15±0,07 9,16±0,04 |
18,29±0,07 13,21±0,05 14,41±0 ,07 |
|
Содержание полисахаридов, % |
1 2 3 |
15,24±0,20 15,12±0,65 14,25±0,65 |
15,95±0,61 16,68±0,76 14,67±0,71 |
9,41±0,40 8,72±0,30 10,42±0,18 |
Настои из листьев подорожника большого и подорожника среднего – это жидкости коричневого цвета, подорожника ланцетного – темно-коричневого цвета; все настои горьковатого вкуса с неспецифическим запахом, pH настоев при комнатной температуре равен 6,0.
Качественными реакциями в настоях листьев подорожника трех видов подтверждено присутствие полисахаридов – осаждением 95 %-ным этиловым спиртом; флавоноидов – реакциями окрашивания с 2 %-ным раствором алюминия хлорида в этиловом спирте, с 10 %-ным раствором натрия гидроксида, с 0,5 %-ным раствором железа окисного хлорида в этиловом спирте, цианидиновой пробой [1].
Для анализа настоев была адаптирована методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид в исходном сырье – листьях подорожника большого [10]. Подобраны объем аликвоты настоя, объем разведения, концентрация этилового спирта, соотношение извлечения и раствора алюминия хлорида, время образования устойчивого комплекса. Затруднения в ходе анализа вызывали осаждение полисахаридов и сорбирование ими флавоноидов, что потребовало постепенного увеличения концентрации этилового спирта и использования 10 %-ного раствора алюминия хлорида для образования устойчивого комплекса.
Методика определения флавоноидов в настое листьев подорожника большого: 5 мл настоя листьев подорожника большого помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили до метки 70 %-ным этиловым спиртом; полученный раствор фильтровали через бумажный складчатый фильтр в колбу вместимостью 25 мл, фильтр промывали, доводили до метки 70 %-ным этиловым спиртом (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 5 мл раствора А и 5 мл 10 %-ного раствора алюминия хлорида, затем добавляли 10 мл 95 %-ного этилового спирта и доводили до метки водой очищенной. Через 40 мин измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 385 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В колбу вместимостью 25 мл для приготовления раствора сравнения добавляли 5 мл раствора А, 10 мл этилового спирта 95 %-ного, и доводили водой очищенной до метки.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид в % (Х) вычисляли по формуле:
, где
А – оптическая плотность испытуемого раствора; 
=361 – удельный показатель поглощения комплекса цинарозида с алюминия хлоридом при 385 нм.
Методика была использована и для определения флавоноидов в настоях из листьев подорожника среднего и подорожника ланцетного. Результаты определений приведены в табл. 2.
Таблица 2
Показатели качества настоев из листьев различных видов рода Plantago L.
|
Наименование показателей |
Номер образца |
Подорожник большой |
Подорожник средний |
Подорожник ланцетный |
|
Содержание флавоноидов в пересчете на цинарозид, % |
1 2 3 |
0,034±0,000 0,024±0,000 0,043±0,001 |
0,053±0,001 0,025±0,003 0,055±0,001 |
0,048±0,001 0,030±0,001 0,042±0,001 |
|
Содержание суммы окисляемых (дубильных) веществ, % |
1 2 3 |
0,26±0,00 0,17±0,00 0,27±0,00 |
0,40±0,00 0,23±0,00 0,76±0,00 |
1,00±0,00 0,77±0,00 0,80±0,00 |
|
Содержание сухого остатка, % |
1 2 3 |
2,96±0,05 2,21±0,02 3,17±0,01 |
3,28±0,06 3,35±0,01 3,21±0,01 |
4,25±0,01 3,31±0,00 4,62±0,02 |
Содержание суммы флавоноидов в настоях листьев составило от 0,024 до 0,053 %; существенных различий между настоями трех видов подорожников не выявлено. Содержание суммы флавоноидов в настоях листьев подорожника различных видов прямо пропорционально их содержанию в исходном сырье (коэффициент корреляции r = 0,816 при доверительной вероятности p=0,05; коэффициент Стьюдента tэксп=3,73, tкрит=2,35).
Содержание суммы окисляемых (дубильных) веществ в настоях различно и варьирует в пределах от 0,17 до 1,00 % (табл. 2). Между содержанием суммы окисляемых (дубильных) веществ в исходном сырье (табл. 1) и в настоях обнаружена прямая корреляционная зависимость (r = 0,939 при p=0,05; tэксп=7,25, tкрит=2,36).
Содержание сухого остатка настоев листьев подорожника большого меньше (2,21–3,17 %), чем соответствующие показатели настоев листьев подорожника среднего (3,21–3,35 %) и подорожника ланцетного (3,31–4,62 %) (табл. 2). Между содержанием суммы окисляемых (дубильных) веществ в настоях листьев подорожника различных видов и сухим остатком выявлена корреляционная зависимость (r = 0,704 при p=0,05; tэксп=2,63, tкрит=2,36). Между содержанием полисахаридов в листьях подорожника различных видов (табл. 1) и соответствующим содержанием сухого остатка настоев (табл. 2) корреляционной зависимости не выявлено (r = -0,612 при p=0,05; tэксп=2,06, tкрит=2,36).
Настои листьев подорожника большого и подорожника ланцетного в условиях эксперимента показали бактерицидную и бактериостатическую активность в отношении Staphylococcus aureus в разведении 1/2-1/8 и не показали активности при разведении 1/16 и более, а также в отношении Escherichia coli и Candida albicans, что для подорожника большого согласуется с литературными [5] и ранее полученными данными [4]. Настой листьев подорожника среднего не проявил активности в отношении тест-штаммов.
Таблица 4
Антимикробная активность настоев из листьев различных видов рода Plantago L.
|
|
Разве-дение |
Настои / Контроль |
|||||
|
Staphylococcus aureus |
Escherichia coli |
Candida albicans |
|||||
|
б/ст |
б/ц |
б/ст |
б/ц |
б/ст |
б/ц |
||
|
Подорожник большой |
1/2 |
- / + |
- / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
|
1/4 |
- / + |
- / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
|
|
1/8 |
- / + |
- / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
|
|
Подорожник средний |
1/2 |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
|
1/4 |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
|
|
1/8 |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
|
|
Подорожник ланцетный |
1/2 |
- / + |
- / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
|
1/4 |
- / + |
- / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
|
|
1/8 |
- / + |
- / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
+ / + |
|
Примечание: «-» задержка роста, «+» наличие роста; б/ст – бактериостатический эффект,
б/ц – бактерицидный эффект.
Выводы
1. Фитохимический анализ показал: содержание в настое листьев подорожника большого флавоноидов в пересчете на цинарозид составляет 0,024-0,043 %, суммы окисляемых веществ – 0,17–0,27 %, сухого остатка – 2,21–3,17 %; в настое листьев подорожника среднего – 0,025–0,055 %, 0,23–0,76 %, 3,21–3,35 % и в настое листьев подорожника ланцетного – 0,030–0,048 %, 0,77–1,00 %, 3,31–4,62 % соответственно. Существенных различий между содержанием флавоноидов, суммы окисляемых веществ и сухого остатка в настоях различных видов Plantago L. не выявлено.
2. Методики, рекомендованные в статье «Настои» проекта ГФ XII издания для определения суммы окисляемых веществ и сухого остатка, а также адаптированная нами методика определения флавоноидов в настоях листьев различных видов рода Plantago L. хорошо воспроизводимы. Между содержанием флавоноидов в листьях различных видов Plantago L. и содержанием их в настоях установлена прямая корреляционная зависимость; аналогично между содержанием суммы окисляемых веществ в соответствующих видах исходного сырья и настоях. Содержание суммы окисляемых веществ в настоях коррелирует с содержанием сухого остатка, что подтверждает объективность анализа.
3. Проведен микробиологический анализ настоев листьев различных видов рода Plantago L.. Настои листьев подорожника большого и подорожника ланцетного показали бактерицидное и бактериостатическое действие к Staphylococcus aureus в разведении 1/2-1/8.
4. Настои листьев различных видов Plantago L. по химическому составу и микробиологическому действию близки между собой и перспективны для дальнейшего изучения с целью введения в медицинскую практику.
Рецензенты:
Алексеева Ирина Владимировна, доктор фармацевтических наук, проректор по учебно-воспитательной работе, профессор кафедры фармацевтической технологии ГБОУ ВПО «Пермской государственной фармацевтической академии» Минздрава России, г. Пермь.
Хомов Юрий Александрович, доктор фармацевтических наук, профессор кафедры фармацевтической химии факультета дополнительного профессионального образования и факультета заочного обучения ГБОУ ВПО «Пермской государственной фармацевтической академии» Минздрава России, г. Пермь.