Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

IONIC MECHANISMS OF CARBON MONOXIDE ON CONTRACTILE ACTIVITY OF VASCULAR SMOOTH MUSCLES

Zheludeva A.S. 1
1 Sibirian State Medical University
С помощью механографии и радионуклидных методов исследовались механизмы действия монооксида углерода (СО) на сократительные реакции сосудистых гладкомышечных клеток (СГМК). Показано, что донор СО - CORM-2, в экспериментах с гиперкалиевой контрактурой в концентрациях 10-1000 мкМ, а в случаях предсокращения гладких мышц фенилэфрином (10 мкМ) от 1 мкМ и выше, дозозависимо расслаблял сосудистые сегменты. Ингибиторы NO-синтазы и растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) ослабляли СО-индуцированную релаксацию сегментов. СORM-2 достоверно уменьшал никардипин-чувствительный вход 45Са2+ в свежевыделенные гладкомышечные клетки аорты. Дозозависимое расслабляющее действие СО обусловлено открыванием потенциал-зависимых и Са2+-активируемых К+-каналов и уменьшением входа Са2+ по потенциал-зависимым Са2+-каналам L-типа сосудистых гладкомышечных клеток. Впервые установлено вовлечение потенциал-зависимых Са2+-каналов L-типа в механизмы расслабляющего действия СО.
Using methods of mechanography and radionuclide techniques we investigated the mechanism of carbon monoxide (CO) action on the contractile responses of vascular smooth muscle cells (SGMK). It was shown that the donor CO - CORM-2 in concentrations of 10-1000 µМ in the case of high potassium contractions, and in concentrations of 1 µМ and above in the case of phenilefrine-induced contractions (10 µМ) of smooth muscles caused a dose-dependent relaxation of vascular segments. Inhibitors of NO-synthase and soluble guanylate cyclase (GC) weakened CO - induced relaxation of the segments. CORM-2 significantly decreased nicardipine-sensitive input of 45Са2+ in freshly isolated aortic smooth muscle cells. Dose-dependent relaxation of the CO is caused by opening of voltage-dependent and Са2+activated K+ channels and by decreasing of Са2+entry through L-type of voltage-dependent Са2+ channels of vascular smooth muscle cells. For the first time we established the involvement of L-type voltage-dependent Са2+ channels in mechanisms of relaxing action of СО.
carbon monoxide.
gasotransmitters
vascular smooth muscle cells

Введение. Монооксид углерода (СО) является представителем так называемых газотрансмиттеров и позиционируется как внутриклеточная сигнальная молекула. Многочисленными исследованиями документирован один из основных физиологических эффектов СО - способность вызывать расслабление артериальных сосудов. Вовлекая различные клеточные и молекулярные каскады, оксид углерода индуцирует вазодилатацию [5, 8, 9]. Эти данные позволяет рассматривать СО как один из факторов, препятствующих локальному вазоспазму и увеличению сосудистого тонуса.

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что расслабление сосудистых гладкомышечных клеток (СГМК) при действии монооксида углерода опосредовано циклическим ГМФ и ковалентной модификацией кальций-активируемых К+-каналов большой проводимости (ВК(Са)) [5]. В последние годы более предпочтительной считается гипотеза о прямом действии СО на ВК(Са)-каналы. Допускается, что α-субъединица ВК(Са)-канала содержит гем-связывающий карман, и ассоциация последнего блокирует этот канал. СО взаимодействует с канал-связанным железом гема и нарушает связь гема с каналом, тем самым приводя к его активации. Таким образом, с этих позиций, ВК(Са)-канал функционально является гемопротеином. Связанный с каналом гем служит рецептором для СО, и ассоциация монооксида углерода с последним повышает чувствительность канала к Са2+. В ГМК ВК(Са)-каналы активируются локальными транзиторными повышениями концентрации Са2+. Поскольку подавление осцилляций кальция или блокирование ВК(Са)-каналов устраняет индуцированное монооксидом углерода расслабление сосудистых гладких мышц, считается, что сопряжение кальциевых вспышек с ВК(Са)-каналом является ключевым звеном в обеспечении релаксирующего действия СО [7]. Активация BK(Ca)-канала, в свою очередь, ведет к гиперполяризации мембраны СГМК, закрыванию потенциал-зависимых Ca2+ каналов и уменьшению входа Са2+ в клетки. [2].

Существенно меньше известно действие монооксида углерода на другие пути транспорта ионов в СГМК. В этой работе мы исследовали действие донора CO на сокращения изолированных сегментов аорты крыс и внутрь направленный транспорт Са2+ в свежевыделенные ГМК из аорты крысы.

Материалы и методы. Исследование сократительной активности гладкомышечных сегментов проводилось с использованием сертифицированной четырехканальной механографической установки Myobath II и аппаратно-программного комплекса LAB-TRAX-4/16 (Германия). Объектом исследования явились изолированные сегменты грудного отдела аорты беспородных белых крыс, которые являются традиционной моделью артериального сосуда мышечного типа. После выделения аорту помещали в физиологически сбалансированный солевой раствор Кребса, с помощью хирургических ножниц отпрепаровывали жировую и соединительную ткань и выделяли сегменты шириной 2-3 мм. Эндотелий удаляли механически, вращением деревянного манипулятора в просвете сегмента в течение 1 минуты непосредственно перед выполнением эксперимента. Сосудистые сегменты предварительно растягивали нагрузкой 500 мг и фиксировали с помощью стальных крючков в термостатируемой камере объемом 10 мл. Измерения механического напряжения гладкомышечных препаратов производилось в изометрическом режиме.

Амплитуду контрольных (100 %) сократительных ответов сосудистых сегментов на действие гиперкалиевого раствора (эквимолярное замещение 30 мM NaCl на KCl) или 10 мкМ фенилэфрина (ФЭ) регистрировали после 40-50 минут выдерживания в нормальном растворе Кребса.

Растворы для перфузии препаратов готовились на основе дистиллированной воды добавлением соответствующих реактивов (ХЧ, «Реахим», Россия). Физиологический раствор Кребса содержал (в мM): 120.4 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl2, 1.2 MgCl2, 5.5 глюкозы, 15 C4H11O3N [tris(oxymethyl)-aminometan] (316.4 мосМ). В растворах поддерживались значения рН 7,35-7,40 и температуры 37,0 ± 0,1°С.

Измерения входящих потоков ионов проводили на свежевыделенных СГМК аорты крысы и использовали в 3-8 пассажах, которые приобретали у Lonza (Walkersville, MD, США). Активность потенциал-зависимых Са2+ каналов L-типа оценивалась как никардипин-чувствительный компонент скорости входа 45Са2+ [7]. В части образцов инкубационная среда содержала 1 мкM никардипина. Через 10 мин инкубации при 37 °С поглощение изотопа было инициировано добавлением гиперкалиевой среды (20 мМ NaCl, 125 мМ KCl), содержащий 3 мкC / мл 45Са2+. Через 5 мин поглощение изотопа была прекращено путем добавления ледяной среды. Радиоактивность инкубационной среды и клеточного лизата определяли на жидкостном сцинтилляционном анализаторе. Скорость входа 45Са2+ (V, нмоль на мг белка за 5 мин.) была рассчитана как V = A/am, где А-радиоактивность образцов (срm), а - специфическая радиоактивность 45Са2+ в среде (срm/нмоль) и m - содержание белка.

Реактивы и статистика. 45CaCl2 Perkin Elmer (Waltman, MA, USA). Остальные химические вещества были получены от Sigma (St. Louis, Миссури, США). Tricarbonyldichlororuthenium(II)-dimer (CORM-2) (Sigma); 1H-[1,2,4] oxadiazolo [4,3-a] quinoxalin-1-one (ODQ) (Sigma); NG-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME) (Sigma); Phenylephrine hydrochloride (Sigma). Никардипин растворяли в 70 % этаноле. Этанол до конечной концентрации 0,1 % не влиял на измеряемые показатели. Анализ данных проводили при помощи программы Statistica 6.0 for Windows фирмы Statsoft. Фактические данные представлены в виде «среднее ± ошибка среднего» (X±m). Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий нормальности Колмогорова-Смирнова. Для проверки гипотезы об однородности двух независимых выборок использовался U-критерий Манна-Уитни (Mann-Whitney U test). Для проверки однородности парных или зависимых, выборок был использован Т-критерий Вилкоксона (Wilcoxon mached pairs test). Достоверность различий определялась при p <0,05.

Результаты и обсуждение. В качестве донора монооксида углерода использовался tricarbonyldichlororuthenium(II)-dimer (CORM-2) [8]. В концентрациях 1-1000 мкМ CORM-2 не влиял на исходное механическое напряжение (МН) исследуемых препаратов, но дозозависимо расслаблял сосудистые сегменты, предсокращенные деполяризацией мембраны в гиперкалиевом растворе (30 мМ KCl) или действием ФЭ (10 мкМ).

Концентрация CORM-2, вызывающая полумаксимальное уменьшение величины МН (ЕС50) сегментов аорты, вызванного действием гиперкалиевого раствора, равнялась 100 мкМ (58.4±6.7%, n=6, р<0.05), а ЕС50 CORM-2 при предсокращении, индуцированном ФЭ (10 мкМ) - (59.7±4.8%, n=6, р<0.05).

Известно, что расслабляющее действие СО на ГМК в значительной степени обусловлено активацией растворимой гуанилатциклазы (рГЦ), которая также является главной мишенью для оксида азота (NO), и расслабляющее действие обоих газов на сосудистые ГМ в значительной степени также обусловлено увеличением внутриклеточной концентрации цГМФ. Для исследования роли цГМФ и NO в механизмах действия монооксида углерода на сосудистые сегменты использовали ингибитор рГЦ - 1H-[1,2,4]-oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-l-one (ODQ) [3] и NG-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME) [4], соответственно. Тестировалось действие CORM-2 в концентрациях, равных ЕС50 для обоих способов предсокращения гладкомышечных сегментов.

Использованные ингибиторы ферментов не влияли на исходное МН сосудистых сегментов и амплитуду сокращений, вызванных действием гиперкалиевого раствора и ФЭ, но достоверно снижали расслабляющее действие CORM-2 на сегменты, предсокращенные действием последних (табл. 1). Полученные данные свидетельствуют о том, что, во-первых, релаксирующее действие СО на сосудистые сегменты, по крайней мере, частично, опосредовано активацией рГЦ, которая считается основной мишенью и для NO, во-вторых, являются указанием на то, что одним из молекулярных каскадов, используемых СО для реализации своего действия на СГМК, является цГМФ.

Для исследования взаимодействия оксидов азота и углерода в процессе трансляции сигнала, индуцированного СО эндогенный синтез оксида азота выключался ингибитром NO-синтазы NG-нитро-L-аргинин метиловым эфиром (L-NAME).

В концентрации 100 мкМ L-NAME не влиял на исходное МН гладкомышечных сегментов аорты, а также амплитуду сокращений, вызванных деполяризацией мембраны при действии гиперкалиевого раствора и ФЭ, но достоверно ослаблял расслабляющее действие CORM-2 на предсокращенные сосудистые сегменты.

После предобработки сосудистых препаратов L-NAME, расслабляющее действие CORM-2 на гладкомышечные е сегменты, предсокращенные в гиперкалиевом растворе или ФЭ, резко уменьшалось (табл. 1).

Следовательно, в условиях угнетения синтеза оксида азота, релаксирующий эффект донора СО достоверно ослаблялся. Полученные данные являются указанием на то, что одним из молекулярных каскадов, используемых СО для реализации своего действия на СГМК, является оксид азота. Имеются основания полагать, что основой синергизма газотрансмиттеров является сенсибилизация оксидом азота рГЦ к действию СО.

В другой серии экспериментов исследовалось влияние монооксида углерода на кальциевую проводимость мембраны исследуемых СГМК. Маркером оперирования потенциал-зависимых Са2+каналов L-типа служил никардипин-чувствительный вход 45Са2+ в изолированные СГМК аорты крысы. Мы исследовали влияние CORM-2 на этот компонент входящего Са2+ тока. Документировано, что СORM-2 дозозависимо уменьшал никардипин-чувствительный вход 45Са2+ в исследуемые клетки (табл. 2).

Таблица 1

Влияние ингибиторов ферментов на эффекты CORM-2 в гладких мышцах аорты, предсокращенных гиперкалиевым раствором (А) и фенилэфрином (Б)

А)

Добавки

Механического напряжения, %

 

Б)

Добавки

Механического напряжения, %

Контроль (30 мМ KCl)

100

Контроль (ФЭ 10-5)

100

30 мМ KCl + CORM-2 (100 мкМ)

58,4±6,7 (*)

ФЭ (10-5) + CORM-2 (10 мкМ)

59,7±4,8 (*)

30 мМ KCl + CORM-2 (100 мкМ) +

L-NAME (100 мкМ)

 

88,7±5,6 (*)

ФЭ (10-5) + CORM-2 (10 мкМ) +

L-NAME (100 мкМ)

 

89,8 ± 4,3 (*)

30 мМ KCl + CORM-2 (100 мкМ) + ODQ (1 мкМ)

 

79,3 ± 3,0 (*)

ФЭ (10-5) + CORM-2 (10 мкМ) + ODQ (1 мкМ)

 

84,6 ± 4,5 (*)

Х±m, полученные в 6 независимых экспериментах.

Величина механического напряжения сосудистых сегментов в отсутствии СОRM-2 принята за 100 %.

* - p<0.05 в сравнении с контролем.

Таблица 2

Дозозависимое действие донора СО - CORM-2 на вход Ca2+ в гладкомышечные клетки аорты крысы

Добавки, мкM

L-тип Ca2+

Каналов, %

Никардипин-резистентный вход Ca2+, %

Нет (контроль)

100

100

CORM-2, 5

92±7

108±5

CORM-2, 10

103±9

89±12

CORM-2, 50

85±7

108±10

CORM-2, 100

72±6*

102±9

CORM-2, 500

64±5**

97±7

Х±m, полученные в 3 независимых экспериментах, выполненных в четырех пробах. Активность L-типа Ca2+ каналов и систем, обеспечивающих никардипин-резистентный вход Ca2+ в отсутствии CORM-2, принята за 100 % *;

** - p<0.05 и 0,002 в сравнении с контролем, соответственно.

Следовательно, приведенные результаты исследований указывают на наличие в СГМК еще одной мишени для монооксида углерода. В самом деле, дозозависимое уменьшение CORM-2 никардипин-чувствительного входа Са2+ свидетельствует в пользу предположения о том, что потенциал-зависимые Са2+ каналы L-типа вовлечены в механизмы расслабляющего действия СО на гладкомышечные сегменты аорты крысы. Вместе с тем, в данных исследованиях мы не можем исключить, что уменьшение никардипин-чувствительного входа 45Са2+ в СГМК аорты крысы связано с блокирующим действием комплексов рутения (Ru (II) на эти каналы. Уточнение данного вопроса имеет принципиальное значение и необходимо проведение дополнительных экспериментов.

Исследование выполнено при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (ГК № 14.740.11.0932, № 16.512.11.2282, соглашение № 8487).

Рецензенты:

Носарев Алексей Валерьевич, доктор медицинских наук, профессор кафедры биофизики и функциональной диагностики ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России, г. Томск.

Капилевич Леонид Владимирович, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой спортивно-оздоровительного туризма, спортивной физиологии и медицины, ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский государственный университет», г. Томск.