Одна из наиболее перспективных задач современной биотехнологии - создание биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов для использования в медицинских целях, пищевой промышленности, в биореакторах и многочисленных аналитических устройствах. Преимущество иммобилизованных ферментов перед растворимыми заключается в большей их стабильности, возможности регенерирования и отделения иммобилизованного фермента от продукта реакции. В качестве таких катализаторов могут использоваться ферменты, включенные в пленочные покрытия.
Современные тенденции при разработке композиционных материалов как основы для иммобилизации состоят в придании им ряда положительных свойств: способность подвергаться разложению в естественных условиях среды, низкий уровень неспецифических взаимодействий с примесями и биологически активными веществами; механическая устойчивость, наличие функциональных групп, пригодных для селективной химической модификации; экологическая чистота процесса получения [12, 14] .
Включение ферментов в структуру природных биоразлагаемых полимеров продиктовано необходимостью создания лекарственных повязок нового поколения с регулируемым сроком службы и высоким процентом сохранения активности биологической субстанции [14].
В отличие от обычных сорбционных перевязочных средств (марлевых, ватно-марлевых, нетканых материалов, полимерных губок), у которых устанавливается динамическое равновесие концентрации микрофлоры на границе «повязка - рана», биологически активные гелевые повязки обеспечивают пластифицирующее воздействие на ткани раны, размягчают некротические образования, диффундируют под них, облегчая механическое удаление нежизнеспособных тканей, и предотвращают развитие инфекции на поверхности раны под струпом [13].
Сегодня, параллельно с применением антибиотиков, возрастает число антибиотико-резистентных штаммов бактерий, частота и тяжесть инфекционных осложнений, попутно изменяющих свои клинические черты. Таким образом, очевидно, что, несмотря на все достижения современной медицины, инфекция не без основания остается «камнем преткновения» на пути дальнейшего развития лечения различных ран. Возникает необходимость в создании принципиально новых препаратов для лечения воспалительных ран.
Альтернативным решением данных проблем могут выступать препараты системной энзимотерапии, относящиеся к группе гидролаз и представленные высокоочищенными протеиназами животного и растительного происхождения, а также фиксированные на различных раневых покрытиях ферментные препараты для местного лечения ран.
Таким образом, существует необходимость разработки новых универсальных и совершенствования уже существующих биоактивных материалов с прогнозируемым сроком сохранения активности, пролонгируемым эффектом и способностью к биодеструкции.
Исследования проводились на базе кафедры биологической и медицинской химии ФГБОУ ВПО СГУ (АОУ ВПО СКФУ) под руководством канд. биол. наук Воробьевой О. В. и Аванесян С. С.
Цель данной работы состояла в разработке технологии получения биодеградируемых полимеров с заданными свойствами на основе возобновляемого природного полисахарида - метилцеллюлозы с иммобилизованными в их структуру протеолитическими ферментами с высоким процентом сохранения удельной активности.
В работе использована метилцеллюлоза марки МЦ-100 с молекулярным весом (162,14) n (ТУ 2231-107-05742755-96, ООО «УсольеХимпром», Россия). Для придания пластичности структуры композиты модифицировали глицерином (ГОСТ 6259-75, ООО «Глицерин.ру», Россия), массовое содержание которого коррелировалось с учетом термодинамической совместимости его с биоразлагаемым материалом. Прочность и жесткость материала обеспечивали введением природного белкового комплекса желатины (ГОСТ 11293-89, ООО «Минводский желатиновый завод», Россия). Для включения в материалы использовали фермент лизоцим из куриных яиц, КФ 3.2.1.17, «Sigma» (Германия) [7].
Пленки формовали из 3-5 % раствора метилцеллюлозы. Для этого метилцеллюлозу вносили в воду температурой 50¸60 °С. Смесь выдерживали 1,5¸2 часа. Температурный режим обусловлен следующими ограничениями. При температуре ниже 50 оС и выше 60 оС процесс гелеобразования замедляется [1].
Для исключения образования пузырьков воздуха в 5 % растворе метилцеллюлозы необходимо выдерживание полученного раствора при температуре 8¸10 оС в течение 12-15 часов.
В полученный коллоидный гель метилцеллюлозы вводили реагент для модификации реологических характеристик, пластификатор, придающий изделию гибкость, и перемешивали до однородного состояния.
В качестве реагента для модификации реологических характеристик использовали белок животного происхождения - желатин в концентрации от 3 до 8 % от общей массы составляющих композиции.
В качестве пластификатора, придающего изделию гибкость, использовали глицерин в концентрации от 0,5 до 1 % от общей массы составляющих композиции. Фермент вводили в раствор компонентов, входящих в состав пленки, в объеме 1 мл.
Полученную композицию наносили на гладкую стеклянную поверхность желаемой формы толщиной от 1 до 3 мм и оставляли на воздухе при температуре 20¸22 ºС на 2-3 суток до полного высыхания (Патент РФ RU№ 2395540) [2].
Проведена иммобилизация фермента класса протеаз лизоцима. Изучено влияние различных факторов (рН, температуры, времени постановки ферментативной реакции) на активность растворимого и иммобилизованного фермента. Фермент лизоцим, иммобилизованный в пленки, проявлял наибольшую удельную активность 290 мэкв/г при рН среды 6,9 и температуре 37 °С, время постановки ферментативной реакции 4 часа. Пленки с иммобилизованным лизоцимом, хранящиеся при температуре 4 ºС, к третьему месяцу хранения имели стабильный процент сохранения биокаталитической активности, а хранящиеся при температуре 20 ºС - потеряли свою активность на 40 % [5].
Для образцов полученных пленочных материалов были проанализированы спектры поглощения в УФ - области. Появление дополнительного пика поглощения при длине волны 280 нм связано с присутствием фермента трипсина в структуре пленки. Этот факт может быть использован для определения содержания фермента в структуре пленки [8].
При иммобилизации фермента лизоцима (муколитического, протеолитического) фермента, в структуру биоразлагаемых пленок была разработана методика определения удельной активности растворимого и иммобилизованного фермента, где в качестве субстрата использовали крахмал. Предлагаемый метод прост в использовании, экспрессен, не требует использования дорогостоящих реактивов и оборудования.
Доказано, что растворимый и иммобилизованный в пленки фермент лизоцим проявлял наибольшую удельную активность при рН 6,9 и температуре 37 °С, которая составила 83,4 мэкв/г и 290 мэкв/г соответственно [6].
В результате проведенных исследований получены биодеградируемые пленочные материалы на основе высокомолекулярного природного полисахарида метилцеллюлозы, белкового комплекса желатина и пластификатора - глицерина. Установлено влияние рН и температуры на активность растворимого и иммобилизованного лизоцима. Определено, что лизоцим, иммобилизованный в пленки, проявлял наибольшую удельную активность 290 мг крахмала/г фермента при рН среды - 6,9 и температуре - 37 °С, при этом время постановки ферментативной реакции составило 4 часа. Показано, что пленки с иммобилизованным лизоцимом, при температуре 4 ºС, к третьему месяцу хранения (90 суток) имели стабильный процент сохранения биокаталитической активности - 80 %. Таким образом, включение в состав биоразлагаемых пленок биологически активных веществ, в том числе протеолитических ферментов, делает возможным расширение спектра представленных на рынке ранозаживляющих материалов.
Рецензенты:
Стародубцева Г. П., доктор сельскохозяйственных наук, профессор, руководитель Учебно-научной испытательной лаборатории ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет», г. Ставрополь.
Лысенко И. О., доктор биологических наук, заведующий кафедрой экологии и ландшафтного строительства ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет», г. Ставрополь.