Печень является центральным органом, в котором протекают основные метаболические процессы обмена белков, липидов и углеводов. Также печень выполняет барьерную функцию, защищая внутреннюю среду организма от попадания чужеродных агентов, инактивируя ксенобиотики. В связи с чем заболевания, связанные с токсическим поражением печени, занимают ведущее место среди патологий, вызывающих необратимые нарушения в функционировании всех систем организма [1].
У животных наиболее близкие к человеку морфологические изменения паренхимы печени возникают после введения в организм четыреххлористого углерода (ССl4). В связи с чем интоксикация животных ССl4 в эксперименте является наиболее эффективной моделью как для обнаружения характерных биохимических нарушений, возникающих при воздействии токсического агента, так и для поиска новых лекарственных средств, обладающих гепатотропными свойствами [4].
Предположительно, гепатотоксический эффект СС14 обусловлен повреждением клеточных структур свободными радикалами, образующимися при метаболизме этого соединения в эндоплазматическом ретикулуме печени [8]. Гепатотоксичность является лишь основным проявлением действия тетрахлорметана, тогда как в условиях окислительного стресса образующиеся свободные радикалы способны оказывать повреждающий эффект и на другие органы пищеварительной системы, что особенно заметно при пероральном поступлении CCl4 в организм человека или животного. Повреждению желудка, кишечника и поджелудочной железы способствуют также нарушения между различными отделами пищеварительной системы, возникающие вторично на фоне формирования острой печеночной недостаточности [5].
В связи с этим проблема изучения биохимических механизмов регуляции функциональной активности пищеварительных желез в условиях воздействия токсических агентов, а также разработка мер, направленных на устранение обнаруживаемых нарушений, в настоящее время является актуальным направлением современной экспериментальной и клинической гепатологии.
Цель настоящего исследования - изучить изменение активности протеиназ желудочно-кишечного тракта крыс, подвергнутых воздействию четыреххлористого углерода, определить патогенетический механизм нарушений и изучить возможность коррекции обнаруженных метаболических изменений при использовании растительных масел.
Материал и методы. В экспериментах использовано 150 белых беспородных крыс самцов весом 150-200 г. В каждой опытной и контрольной группе животные были одного возраста и веса. Они содержались в стандартных условиях, с соблюдением всех правил и международных рекомендаций [3].
Опытные животные были распределены на следующие группы. Первая группа (25 крыс) - интактные животные. Вторая группа (25 крыс) - животные с моделью токсического поражения печени, вызванного введением четыреххлористого углерода, исследование биохимических параметров у которых производилось на 7 сутки после начала эксперимента. Третья группа (25 крыс) - животные с моделью токсического поражения печени, вызванного введением четыреххлористого углерода, исследование биохимических параметров у которых производилось на 30 сутки после начала эксперимента. Четвертая группа (75 крыс) - животные с предварительно созданным экспериментальным токсическим гепатитом, которым по гастральному зонду вводили изучаемые масла: масло черного ореха - подгруппа IVА (n=25), масло грецкого ореха - подгруппа IVБ (n=25), льняное масло - подгруппа IVВ (n=25).
Для создания модели острого токсического поражения печени крысам подкожно вводили 50 % масляный раствор CCl4 из расчета 0,5 мл на 100 г массы тела животного один раз в сутки в течение трех суток [4]. Забор крови и внутренних органов (желудка, поджелудочной железы) для исследования у животных опытных и контрольной групп проводили на 7 и на 30 сутки после начала эксперимента путем декапитации под нембуталовым наркозом (35 мг/кг). Забой крыс производили после их 14-часового голодания, в утренние часы, согласно принятым на этот счет инструкциям и законодательным актам [3]. Органы животных промывали холодным физиологическим раствором, участки слизистой желудка отделяли от серозной оболочки и тщательно измельчали. Также измельчали отдельно поджелудочную железу. Измельченные органы взвешивали и готовили из них 10 %-ные гомогенаты на дистиллированной воде и активировали их. Для активации в гомогенаты желудка добавляли 0,1 н. раствор НCI в расчете 0,2 мл НCI на 1 мл гомогената. Далее инкубировали в водяном термостате в течение 1 часа при температуре 37 оС. После этого центрифугировали в течение 15 минут при 3000 об/мин, отделяли надосадочную жидкость и определяли в ней активность ферментов.
Для определения активности пепсина в гомогенатах слизистой оболочки желудка был использован экспресс-метод Н. П. Пятницкого [1968]. Метод основан на способности пепсина створаживать забуференное молоко (молочно-ацетную смесь, МАС) при рН 5,0 и температуре 25 оС. Время появления хлопьев казеина в пробирке находится в обратной зависимости от активности фермента. Данный метод позволяет определять количество пепсина не только в условных единицах, но, пользуясь эталонным раствором кристаллического пепсина, и в миллиграммах. Активность фермента выражали в мг/г влажной ткани слизистой оболочки желудка [11]. Определение активности трипсина в гомогенатах поджелудочной железы проводили методом Эрлангера - Шатерникова. Метод основан на способности трипсина расщеплять синтетический субстрат - бензоиларгинин-р-нитроанилид (БАПНА) с образованием окрашенного р-нитроанилида, количество которого, определяемого колориметрически (l = 410 нм), пропорционально активности фермента [9]. Активность трипсина выражали в мг на 1 г влажной ткани поджелудочной железы. Активность химотрипсина в гомогенатах поджелудочной железы определяли по методу Н. П. Пятницкого (1965). Этот метод имеет сходство с методом определения пепсина в желудочном соке и основан на способности фермента свертывать молочно-ацетатную смесь при температуре 35 оС. Активность химотрипсина выражали в условных единицах на 1 г влажной ткани поджелудочной железы [10].
Для выявления наиболее вероятной причины изменения активности пищеварительных протеиназ исследовали активность протекания процессов ПОЛ по реакции между вторичными продуктами липопероксидации и тиобарбитуровой кислотой (определяли содержание в крови ТБК-реактивных продуктов - ТБК-РП) [6], а также проводили изучение активности ферментов антирадикальной защиты эритроцитов - каталазы и супероксиддисмутазы (СОД). Активность СОД определяли по методу В. А. Костюка и соавт. [1990]. Активность каталазы определяли колориметрическим методом по М. А. Королюку и соавт. [1988].
Все исследования были выполнены в день забора крови и внутренних органов.
Полученные экспериментальные данные были обработаны методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверным считали различие при р<0,05 [2].
Результаты и обсуждение. Под действием CCl4 в организме крыс наблюдалось снижение активности протеолитических ферментов желудка и поджелудочной железы (табл. 1). На 7 сутки от начала эксперимента активность пепсина снизилась на 51 % (р<0,001), трипсина - на 77,9 % (р<0,001), химотрипсина - на 69,9 % (р<0,001) по сравнению с данными, полученными в контрольной группе. На 30 сутки от начала эксперимента наблюдалось увеличение активности протеиназ по сравнению с данными, полученными во II опытной группе. Так, активность пепсина в III группе была выше соответствующего параметра во II на 62 % (р<0,001), трипсина - на 54,2 % (р<0,001), химотрипсина - на 114,6 % (р<0,001). Однако активность всех изучаемых протеаз в III экспериментальной группе была ниже контрольных значений.
Таблица 1
Активность протеолитических ферментов слизистой оболочки желудка и ткани поджелудочной железы крыс при острой интоксикации четыреххлористым углеродом (М±m)
|
Исследуемый показатель |
Группы животных |
||
|
I (контрольная) |
II (7 суток от начала эксперимента) |
III (30 суток от начала эксперимента) |
|
|
Пепсин, мг/г |
1,45±0,06 |
0,71±0,02 р2-1<0,001 |
1,15±0,02 р3-1<0,001 р3-2<0,001 |
|
Трипсин, мг/г |
22,68±0,22 |
5,02±0,08 р2-1<0,001 |
7,74±0,09 р3-1<0,001 р3-2<0,001 |
|
Химотрипсин, ед/г |
1,36±0,04 |
0,41±0,01 р2-1<0,001 |
0,88±0,01 р3-1<0,001 р3-2<0,001 |
Наиболее вероятным механизмом, способствующим снижению образования пищеварительных ферментов, является повреждение железистого аппарата поджелудочной железы и ЖКТ свободными радикалами, образующимися в организме животного под действием CCl4. Так, согласно полученным данным, при интоксикации тетрахлорметаном, в крови животных наблюдалась активация процессов ПОЛ и дисбаланс в работе ферментативного звена системы антирадикальной защиты организма. У крыс после введения CCl4 на 7 сутки наблюдалось повышение содержания ТБК-РП на 74,8 % (р<0,001), снижение активности как СОД на 37,2 % (р<0,001), так и каталазы на 57,1 % (р<0,001) по сравнению с контрольной группой. Вследствие более выраженного ингибирования каталазы, значение коэффициента каталаза/СОД во II группе было ниже на 30,3 % (р<0,001) по сравнению с контролем. На 30 сутки эксперимента концентрация ТБК-РП в III группе была выше на 80,0 % (р<0,001) по сравнению с данными, полученными во II группе и в 3,1 раза (р<0,001) превышала нормальные значения. В крови животных больных III группы активность СОД снижалась на 56,2 % (р<0,001) по сравнению с данными в контрольной группе и на 30,2 % (р<0,01) по сравнению с показателями во II группе. Изменения в активности каталазы носили однонаправленный характер по отношению к СОД. Так, в гемолизате эритроцитов крыс III группы активность каталазы снижалась на 60,2 % (р<0,001) по сравнению с данными в контрольной группе и на 7,0 % (р<0,001) по сравнению с показателями во II группе. Значение коэффициента каталаза/СОД в III экспериментальной группе составило 2,75±0,08 усл. ед., что на 8,3 % (р<0,02) ниже по сравнению с данными в контрольной группе (3,00±0,06 усл. ед.) и на 36,1 % (р<0,001) выше по сравнению с данными во II группе (2,09±0,08 усл. ед.).
Введение в организм животных растительных масел способствовало увеличению активности протеолитических ферментов по сравнению с данными, полученными в группе III (табл. 2). В группах животных, получавших лечение маслом черного ореха и льняным маслом, содержание пепсина достигло уровня интактных крыс, под действием льняного масла также нормализовался синтез химотрипсина.
Таблица 2
Активность протеолитических ферментов слизистой оболочки желудка и ткани поджелудочной железы животных с моделью острого токсического поражения печени, находящихся на лечении исследуемыми гепатопротекторами (М±m)
|
Группы крыс |
n |
Пепсин, мг/г |
Трипсин, мг/г |
Химотрипсин, ед/г |
|
IVА (масло черного ореха) |
25 |
1,33±0,02 р4А-3<0,001 р4А-1<0,5 |
18,67±0,13 р4А-3<0,001 р4А-1<0,001 |
1,27±0,01 р4А-3<0,001 р4А-1<0,05 |
|
IVБ (масло грецкого ореха) |
25 |
1,31±0,02 р4Б-3<0,001 р4Б-1<0,05 |
18,95±0,21 р4Б-3<0,001 р4Б-1<0,001 |
1,26±0,01 р4Б-3<0,001 р4Б-1<0,02 |
|
IVВ (льняное масло) |
25 |
1,36±0,01 р4Г-3<0,001 р4Г-1<0,5 |
19,47±0,17 р4Г-3<0,001 р4Г-1<0,001 |
1,29±0,17 р4Г-3<0,001 р4Г-1<0,5 |
|
III (ССl4, 30 суток от начала эксперимента) |
25 |
1,15±0,02 |
7,74±0,09 |
0,88±0,01 |
|
I (контрольная) |
25 |
1,45±0,06 |
22,68±0,22 |
1,36±0,04 |
Введение в организм животных растительных масел способствовало также выраженному снижению содержания в сыворотке крови ТБК-РП относительно группы сравнения. В IVА уровень ТБК-РП снизился на 17,6 % (р<0,001), в IVБ - на 21,9% (р<0,001), в IVВ - на 11,1 % (р<0,001) по сравнению с данными, полученными у крыс III группы. Изменение активности ферментов антирадикальной защиты эритроцитов в группах, IVА, IVБ, IVВ носили однонаправленный характер: наблюдалось выраженное увеличение активности как СОД, так и каталазы по сравнению с данными, полученными в группе III. Так, активность СОД в IVА группе увеличилась на 54,6 % (р<0,001), в IVБ - на 42,4 % (р<0,001), в IVВ - на 25,5 % (р<0,001). Активность каталазы возросла группе IVА на 60,3 % (р<0,001), в IVБ - на 49,2 % (р<0,001), в IVВ - на 33,0 % (р<0,001) относительно данных, полученных в группе сравнения.
Биохимические процессы, протекающие в крови, сопоставимы с процессами в клетках других органов, в связи с чем наиболее вероятной причиной увеличения содержания протеолитических ферментов в поджелудочной железе и желудке у экспериментальных животных является антиоксидантное действие растительных масел, способствующее восстановлению нормальной структуры и функции поврежденных клеток.
Выводы
Под воздействием четыреххлористого углерода у крыс наблюдалась активация процессов ПОЛ, дисбаланс в работе ферментативного звена антирадикальной системы крови, следствием чего явилось свободнорадикальное повреждение клеток желудка и поджелудочной железы, что проявилось снижением выработки протеолитических ферментов указанными органами.
Использование исследуемых растительных масел для лечения экспериментальных животных с моделью острого токсического поражения печени способствовало снижению интенсивности процессов липопероксидации, нормализации работы ферментов антирадикальной защиты, а также характеризовалось тенденцией к восстановлению выработки пищеварительных протеиназ, что создает предпосылки для дальнейшего использования изучаемых растительных масел в комплексном лечении патологических состояний, возникающих после попадания в организм человека различных токсических агентов.
Рецензенты:
Каде Азамат Халидович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой общей и клинической патофизиологии, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Краснодар.
Литвинова Татьяна Николаевна, доктор педагогических наук, профессор, профессор кафедры фундаментальной и клинической биохимии, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Краснодар.