Целью исследования явились изучение возможности определения и валидационная оценка результатов анализа артикаина [4] в моче капиллярным электрофорезом на приборе «Капель-105».
Важными вопросами при количественном определении лекарственных веществ в биологических жидкостях и субстратах (в том числе и моче) методом капиллярного электрофореза являются вопросы пробоподготовки (изолирование из объектов и концентрирование исследуемых соединений). В биообъектах возможно присутствие различных эндогенных компонентов, на фоне которых затрудняется детектирование искомых соединений в микрограммовых количествах. Кроме того, фотометрическое детектирование разделённых компонентов происходит непосредственно в капилляре, вследствие этого чувствительность детекции ограничена малой длиной оптического пути, равного внутреннему диаметру капилляра.
При разработке методики количественного определения артикаина в моче с использованием капиллярного электрофореза («Капель-105») эти осложняющие проблемы решали тем, что на этапе пробоподготовки для получения в достаточной степени очищенной и сконцентрированной пробы использовали жидкостно-жидкостную экстракцию хлороформом с последующим реэкстрагированием исследуемых компонентов в рабочий электролит, разбавленный водой в 10 раз. При этом перевод исследуемых компонентов в рабочий электролит, разбавленный водой в 10 раз, позволяет в процессе электрофореза в кварцевом капилляре дополнительно осуществить концентрирование пробы за счёт явления «стекинга». Данное явление происходит, когда ионы аналитов пересекают границу, которая отделяет зону низкой проводимости раствора образца и высокой - ведущего электролита. В случае, если матрица образца имеет значительно более низкую проводимость (обычно за счёт разбавления буфером или водой), чем ведущий электролит, в зоне образца возникает относительно высокое электрическое поле. Аналиты внутри зоны образца движутся с более высокой локальной скоростью, и, замедляясь на границе с зоной ведущего электролита, концентрируются.
При разработке методики количественного определения артикаина были использованы ранее изученные условия электрофореза с целью его идентификации на приборе «Капель-105» [6].
На основании проведённых исследований оптимальными условиями электрофореза являются:
-
Рабочий электролит (РЭ) - буферный раствор Бриттона - Робинсона, рН 2,3.
-
Растворитель пробы (РП) - РЭ, разбавленный в 10 раз водой.
-
Ввод пробы - давлением (30 мбар * 15 сек).
-
Положительный электрод со стороны введения РЭ, напряжение: 20 кВ.
-
Детектирование - встроенный УФ-фотометрический детектор, 270 нм.
-
Последовательная промывка капилляра между анализами:
а) по полной схеме (между первым и четвёртым анализами): 0,5М раствором хлористоводородной кислоты - 10 мин, водой очищенной - 10 мин, 0,5М раствором натрия гидроксида - 10 мин, водой очищенной - 10 мин, РЭ - 10 мин. Проведение холостого электрофореза - 15 мин: положительный электрод со стороны введения РЭ, напряжение: 20 кВ.;
б) по короткой схеме (между вторым и третьим анализами): РЭ - 10 мин. Проведение холостого электрофореза в тех же условиях, как и по полной схеме.
Запись и обработка данных анализа проводилась с помощью программного обеспечения «МультиХром для Windows».
При идентификации артикаина на ЭФГ нами рассчитаны наблюдаемое время миграции (tм), исправленное время миграции (tи) с использованием в качестве маркера ЭОП бензилового спирта, что позволило устранить колебания времени миграции. Значение tи и\спользовали для построения ЭФС, с помощью которого рассчитывали количественные характеристики: константу ионизации (рКа) и внутренние коэффициенты подвижности Рi, дающие более полное представление об ионном состоянии вещества и увеличивающие надёжность идентификации методом капиллярного электрофореза [6].
При количественном определении для подтверждения фактора линейности строили график зависимости фотометрических сигналов (площади пиков) от концентрации артикаина
на 5 уровнях концентраций его стандартных растворов [1, 5]. Готовили серию разведений стандартного раствора артикаина в буферном растворе Бриттона - Робинсона рН 2,3, разбавленном в 10 раз водой. Электрофоретические исследования полученных рабочих стандартных растворов проводили с использование прибора «Капель-105» в избранных условиях. Запись и обработку полученных электрофореграмм производили с помощью программного обеспечения «МультиХром для Windows». Электрофореграмма артикаина с концентрацией 15 мкг/мл представлена на рисунке 1.
Рисунок 1. Электрофореграмма артикаина (15 мкг/мл). «Капель-105»
РЭ - буферный раствор Бриттона-Робинсона, рН 2,3.
Ввод пробы: давлением (30 мбар * 15 сек).
Рабочее напряжение: 20 кВ. Детектирование: 270 нм.
Линейная зависимость фотометрического сигнала от концентрации артикаина, наблюдаемая в интервале концентраций от 1 до 20 мкг/мл, была аппроксимирована линейным уравнением с помощью метода наименьших квадратов на ПК. Полученное уравнение имеет вид:
Y = 0,4798 Х - 0,0368
Критерием приемлемости линейности является и коэффициент корреляции, который составил 0,9999. Его величина близка к 1 и совокупность данных можно описать прямой линией, что и видно из рисунка 2.
Рисунок 2. Калибровочный график для количественного определения артикаина методом капиллярного электрофореза ("Капель-105")
Таким образом, методика валидна по критерию линейности, и в данных интервалах концентраций обеспечивает определение с требуемой правильностью.
Для результатов анализа при исследовании биологических жидкостей важнейшее значение имеет способ пробоподготовки анализируемого вещества.
При изучении влияния рН среды, природы органического растворителя, кратности экстрагирования на степень экстракции артикаина из водных растворов было установлено, что максимальное количество артикаина экстрагируется хлороформом при рН 9 при однократной экстракции объёмом 5 мл и соотношении водной и органической фаз 1 : 1.
Для устранения фонового влияния сопутствующих балластных веществ мочи использовали приём реэкстракции исследуемых компонентов из хлороформного извлечения в рабочий электролит, разбавленный водой в 10 раз.
При количественном определении артикаина в условиях модельного эксперимента к 1 мл мочи с известным содержанием исследуемого вещества добавляли 4 мл буферного раствора Бриттона - Робинсона рН 9 и проводили экстракцию 5 мл хлороформа (шейкер, 10 мин). Эмульсии разрушали центрифугированием (6000 об/мин, 10 мин). Хлороформный экстракт отделяли, добавляли к нему 1,0 мл РП (буферного раствора Бриттона - Робинсона, рН 2,3, разбавленного в 10 раз водой) и проводили реэкстракцию (шейкер, 10 мин). Реэкстракт отделяли, центрифугировали в пробирках для образца типа «эппендорф» в мини-центрифуге («MiniSpin plus», 10000 об/мин, 5 мин) и использовали для количественного определения артикаина по разработанной электрофоретической методике. Результаты определения артикаина в моче представлены в таблице 1.
Таблица 1 Количественное определение артикаина в моче методом капелльного электрофореза (Капель-105)
|
Концентрация артикаина в модельной смеси, мкг/мл |
Найдено артикаина после изолирования |
Метрологические характеристики |
|
|
мкг/мл |
% |
||
|
20 |
14,65 |
73,25 |
S = 0,48
S
Δ
|
|
14,76 |
73,80 |
||
|
14,57 |
72,85 |
||
|
|
73,30 |
||
|
1 |
0,718 |
71,80 |
S = 0,77
S
Δ
|
|
0,713 |
71,30 |
||
|
0,727 |
72,70 |
||
|
|
71,93 |
||
|
0,5 |
0,358 |
71,60 |
S = 2,80
S
Δ
|
|
0,338 |
67,60 |
||
|
0,331 |
66,20 |
||
|
|
68,47 |
||
= 0,28
= 1,64
Как видно из таблицы, при статистической обработке данных, полученных в ходе количественного определения артикаина в модельных пробах мочи на трёх уровнях концентраций отражается вполне удовлетворительная сходимость результатов в пределах рекомендуемой аналитической области. Рассчитанное стандартное отклонение среднего результата находится в пределах критерия приемлемости. Методика не отягощена грубой и систематической ошибкой, является правильной и позволяет получать воспроизводимые результаты.
Таким образом, разработанная методика применима для количественного определения артикаина в моче и может быть рекомендована для использования при химико-токсикологических анализах.
Выводы
- Разработана методика определения артикаина в моче на основе прямой экстракции хлороформом с последующей реэкстракцией анализируемого вещества в рабочий электролит, разбавленный водой, и электрофоретического исследования на приборе «Капель - 105».
- Показано, что по разработанной методике пробоподготовки балластные вещества мочи не мешают фотометрическому определению артикаина.
- Проведена валидационная оценка методики определения артикаина. При статистической обработке полученные результаты находятся в пределах критериев приемлемости.
Рецензенты:
-
Михалев А. И., д. фарм. н., профессор, зав. кафедрой биологической химии, ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития, г. Пермь.
-
Гейн В. Л., д. хим. н., профессор, зав. кафедрой физической и коллоидной химии, ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития, г. Пермь.