Окислительный стресс, как возникающий дисбаланс в системе «прооксидант - антиоксидант», является важным патогенетическим фактором развития многих заболеваний, в том числе язвенной болезни желудка. Несмотря на достигнутые в последние годы успехи в совершенствовании способов лечения и профилактики гастропатий, отмечается их дальнейший рост и повышение частоты развития осложнений, ведущих к длительной потере трудоспособности пациентов, а иногда и к смерти. Довольно часто заболевания желудочно-кишечного тракта характеризуются хроническим рецидивирующим течением и сочетанной патологией нескольких органов, что определяет специфику терапевтического воздействия: оно должно быть достаточно длительным и комплексным, что предполагает применение лекарственных средств широкого спектра фармакологической активности [6].
В настоящее время большое внимание уделяется поиску биологически активных соединений растительного происхождения, обладающих антиоксидантным действием, для последующего создания на их основе высокоэффективных лекарственных средств, предназначенных для восстановления про/антиоксидантного равновесия в организме [2]. В этом отношении перспективным объектом являются цветки бархатцев распростертых [9], влияющие на различные звенья патогенеза язвенной болезни, в то же время нетоксичные и хорошо переносимые. В качестве гастропротекторного средства целесообразно использовать сухой экстракт из бархатцев распростёртых.
Целью нашей работы явилось изучение химического состава сухого экстракта из цветков бархатцев распростертых, определение количественного содержания в нём флавоноидов и влияние его на интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) и состояние антиоксидантной системы желудка при язвенном поражении вольтареном.
Материалы и методы исследования
Предварительно нами были определены биологически активные вещества в изучаемом объекте, наибольший интерес из которых вызывают флавоноиды. Для качественного определения флавоноидов использовали химические реакции и тонкослойную хроматографию (ТСХ). Количественное определение флавоноидов проводили методом дифференциальной спектрофотометрии, используя реакцию взаимодействия с 2%-ным спиртовым раствором алюминия хлорида в максимуме светопоглощения при 427 нм [1; 7].
Модель вольтаренового поражения слизистой оболочки желудка (СОЖ) воспроизводили на белых беспородных крысах-самках массой 200-220 г путем двухдневного перорального введения «Вольтарена» фирмы Novartis в дозе 50 мг/кг в виде водной суспензии. Были исследованы следующие субстанции, полученные из травы бархатцев распростертых: сухой экстракт в дозе 100 мг/кг, водорастворимые полисахариды (ВРПС) в дозе 100 мг/кг, пектины в дозе 50 мг/кг и липофильная фракция (ЛФ) в дозе 60 мг/кг. В качестве препаратов сравнения использовали «Плантаглюцид» в дозе 250 мг/кг и облепиховое масло в дозе 5 мл/кг. Вещества вводили интрагастрально за пять дней до введения «Вольтарена» [4] и затем на фоне воспроизведения поражения СОЖ. Контрольной группе животных вводили такой же объем растворителя. Эвтаназию животных проводили через 24 часа в соответствии с рекомендациями Европейской конвенции по охране позвоночных животных. Желудок вскрывали по большой кривизне, промывали 0,9%-ным физиологическим раствором натрия хлорида. Об интенсивности ПОЛ судили по содержанию ТБК-активных продуктов в гомогенате желудка [10] и сыворотке крови [11]; состояние антиоксидантной системы (АОС) СОЖ оценивали по содержанию восстановленного глутатиона (GSH) [5] в гомогенате, активности каталазы, глутатион-S-трансферазы в постъядерной фракции и общей антиокислительной активности (АОА) сыворотки крови. В СОЖ определяли содержание белка по методу Лоури и соавт. в модификации Миллера [8]. Статистическую обработку полученных данных проводили методом вариационной статистики с использованием критерия (t) Стьюдента.
Результаты исследования
Для идентификации флавоноидов в сухом экстракте бархатцев распростёртых использовали различные реактивы. В результате взаимодействия с трёххлористой сурьмой наблюдали жёлтое окрашивание, с раствором аммиака при нагревании флавоноиды дают характерное окрашивание при нагревании, переходящее в оранжевое. Цианидиновая проба привела к появлению красного окрашивания. Кроме того, в качестве реактивов мы предлагаем применять железа (III) хлорид, алюминия хлорид, в результате чего были получены окрашенные комплексные соединения, а также цветные реакции с натрия нитритом и образование азокрасителя. Хроматографическое исследование (метод ТСХ) показало наличие в сухом экстракте из цветков бархатцев нескольких флавоноидов. Применение метода ТСХ оказалось предпочтительным для идентификации флавоноидов в системе: бутанол - уксусная кислота - вода (4 : 1 : 5) с использованием свидетелей, которыми являлись достоверные стандартные образцы кверцетина и рутина. В результате проведённых исследований установили количественное содержание суммы флавоноидов в объекте исследования. Расчёт содержания суммы флавоноидов проводили с использованием значения удельного показателя поглощения для продукта взаимодействия кверцетина с алюминия хлоридом (764,6). Количественное содержание суммы флавоноидов в пересчёте на кверцетин в сухом экстракте составило 3,95%. Относительная погрешность определения равна ±2,3%.
Биохимический анализ слизистой оболочки желудка и сыворотки крови крыс показал, что у контрольных животных наблюдалось достоверное снижение содержания ТБК-активных продуктов желудка на 59%, но было повышено содержание ТБК-активных продуктов в сыворотке крови на 106%. Известно, что среди факторов, приводящих к уменьшению сопротивляемости слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта при воздействии ульцерогеннных агентов, одно из ведущих мест принадлежит снижению концентрации S Н-соединений, особенно восстановленного глутатиона [3], что отмечалось и в нашем эксперименте. Наблюдалось снижение содержания в желудке GSH на 54% по отношению к нормальному уровню, значительное падение активности антиперекисного фермента - каталазы на 54%, уменьшение активности важнейшего фермента детоксикации глутатион-S-трансферазы на 64%, а также регистрировалось падение АОА сыворотки крови на 43%.
Таким образом, при вольтареновой язве желудка у крыс выявлено снижение как неферментативного, так и ферментативного звеньев антиоксидантной защиты, а также падение интенсивности и процессов ПОЛ. Последнее, вероятнее всего, явилось следствием первичной активации ПОЛ в более ранние сроки повреждения слизистой желудка, что подтверждается, например, сохранившимся повышенным уровнем ТБК-активных продуктов в сыворотке крови.
Таблица 1 - Изменение показателй ПОЛ и АОС желудка при введении субстанций из цветков бархатцев распростертых на фоне вольтареновой гастропатии у крыс
|
Группы животных n=6 |
Показатели |
|||||
|
ТБК-активные продукты сыв. крови, нмоль/мг белка |
ТБК-активные продукты СОЖ, мкмоль/л |
АОА сыв. крови, % |
Глутатион- S-трансфераза, нмоль/мг белка |
GSH, мг/г |
Каталаза уд. акт/мг белка |
|
|
Интактные |
1,16±0,01 |
0,22±0,013 |
89,0±3,20 |
25,14±0,29 |
2,6±0,13 |
0,24±0,016 |
|
Контроль |
2,4±0,16+ +106% |
0,09±0,01+ -59% |
50,7±3,89+ -43% |
16,2±1,23+ -64% |
1,2±0,07+ -54% |
0,11±0,010+ -54% |
|
Сухой экстракт, 100 мг/кг |
1,28±0,19* -47% |
0,18±0,025* +100% |
86,7±2,10* +71% |
21,53±1,06 +33% |
2,2±0,14 +83% |
0,19±0,015 +73% |
|
ВРПС, 100 мг/кг |
3,13±0,24*+30% |
0,11±0,032 |
70,0±3,16* +38% |
18,32±0,67+ |
1,9±0,11* +58% |
0,18±0,02* +64% |
|
Пектины, 50 мг/кг |
1,44±0,29 -40% |
0,18±0,011* +100% |
69,0±2,61* +36% |
20,56±1,42* +27% |
1,6±0,14* +33% |
0,19±0,005* +73% |
|
ЛФ, 60 мг/кг |
2,54±0,5+
|
0,16±0,027* +78% |
81,2±2,47* +60% |
21,2±0,56* +31% |
2,0±0,09* +67% |
0,22±0,01* +100% |
|
Плантаглюцид, 250 мг/кг |
2,6±0,26+
|
0,12±0,018+
|
79,7±1,56* +57% |
17,22±0,34+ |
1,8±0,16* +50% |
0,14±0,031+
|
|
Облепиховое масло, 5 мл/кг |
1,21±0,24* -50% |
0,1±0,007+
|
64,0±3,29* +26% |
18,55±1,67+ |
1,25±0,07+ |
0,17±0,023* +55% |
٭ - Рк<0,05 по отношению к контролю;
+ - Ри<0,05 по отношению к интактным значениям;
n - количество животных в группе.
После предварительного введения сухого экстракта в дозе 100 мг/кг и пектинов в дозе 50 мг/кг отмечалась практически полная нормализация содержания ТБК-активных продуктов в крови и желудке, GSH, каталазы в желудке и АОА в крови (табл. 1). Под влиянием ЛФ отмечалась почти полная нормализация активности каталазы, достоверно увеличились уровень GSH и глутатион-S-трансферазы на 67% и 31% соответственно, также увеличились уровень ТБК-активных продуктов крови и АОА на 78% и 60% соответственно. При введении ВРПС все исследуемые биохимические показатели оказались практически на уровне контроля. Препарат сравнения плантаглюцид показал увеличение уровня АОА крови и GSH на 57% и 50% соответственно, а под влиянием облепихового масла отмечалась практически полная нормализация содержания ТБК-активных продуктов в крови, уровень каталазы увеличился на 55%.
Среди изученных субстанций наиболее эффективное влияние на интенсивность ПОЛ и активность основных компонентов эндогенной АОС желудка показал сухой экстракт, введение которого в большей степени, чем применение других субстанций, оказало гастрозащитное действие при вольтареновой язве. В результате его лечебно-профилактического применения в дозе 100 мг/кг выявлена нормализация всех исследуемых показателей состояния про/антиоксидантного равновесия, повышая тем самым резистентность слизистой желудка к ульцерогенному воздействию.
Заключение
- С помощью химических реакций и методом ТСХ подтверждено наличие рутина и кверцетина в сухом экстракте бархатцев распростёртых.
- Методом дифференциальной спектрофотометрии с раствором алюминия хлорида установлено количественное содержание суммы флавоноидов в пересчёте на кверцетин (3,95%).
- При вольтареновой язве желудка происходит снижение активности как окислительных процессов, так и механизмов антиоксидантной защиты.
- Введение исследуемых субстанций по лечебно-профилактической схеме на фоне вольтареновой гастропатии способствует устранению тех сдвигов, которые наблюдались в системе ПОЛ/АОЗ, и по эффективности своего действия наиболее значимым оказался сухой экстракт в дозе 100 мг/кг.
- Применение сухого экстракта в дозе 100 мг/кг в большей степени по сравнению с другими субстанциями оказало нормализующее влияние на систему глутатиона, что способствует восстановлению активности антиоксидантных и детоксикационных процессов в клетках желудка.
Рецензенты:
- Ивашев М.Н., д.м.н., профессор, зав. кафедрой клинической фармакологии ФГБОУ ВПО «Пятигорская ГФА» Минздравсоцразвития России, г. Пятигорск.
- Погорелый В.Е., д.б.н., профессор кафедры фармакологии и патологии ФГБОУ ВПО «Пятигорская ГФА» Минздравсоцразвития России, г. Пятигорск.