Предметом исследований послужил селен, в аспекте разработки новых пищевых добавок с биопротекторными свойствами для алиментарной коррекции селендефицитных состояний различных детерминированных групп населения, путем получения иммобилизованных на белковых носителях его малотоксичных форм с последующим использованием в составе пищевых систем на основе сырья животного происхождения. Показано (Тутельян и др., 2002 г.), что ферментативная защита организма, построенная на селене, способствует торможению многих патологических процессов, как на клеточном, так и на организменном уровне. Трудно переоценить роль этого микроэлемента в профилактике и лечении многих заболеваний [7].
Весьма перспективно использование органических производных селена, из-за почти полного отсутствия у них токсичности [4]. К таким источникам селена относится диметилдипирозолилселенид, который был синтезирован в конце прошлого века, в 2002 г. разрешен в качестве БАД. Он представляет собой белый порошок. Препарат относится к соединениям, где валентность металла равна 2. Существуют данные, что соединения двухвалентного селена относительно быстро всасываются в кишечнике и быстро распределяются в тканях. Диметилдипирозолилселенид оказывает антиоксидантное действие. Снижая и предотвращая накопление токсичных продуктов перекисного окисления липидов, он способствует нормализации обмена веществ [8]. Однако непосредственное его использование как компонента рецептур продуктов питания широкого потребительского спроса проблематично из-за сложности равномерного распределения по объему продукта.
Цель работы - изучение возможности получения иммобилизованных на коллагеновых носителях форм диметилдипиразолилселенида путем расчета квантово-механических характеристик продуктов их взаимодействия и построения гипотетической пространственной модели.
Объектами исследования служили: водный раствор диметилпиразолилселенида (ДДС) с содержанием диметилпиразолилселенида 0,657 г в 100 см3, продукты биомодификации отходов жиловки (смесь жилок и сухожилий крупного рогатого скота) при их обработке по следующей схеме: измельчение на волчке, промывка проточной водой, ферментативный гидролиз белковых фракций с использованием ферментного препарата «Коллагеназа пищевая» с повторной промывкой, пероксидно-щелочной гидролиз, а также продукты последующей иммобилизации ДДС на биомодфицировнных коллагеновых носителях.
При выборе объектов для иммобилизации диметилдипиразолилселенида использовали данные по аминокислотному составу продуктов биомодификации (таблица 1), полученные на автоматическом аминокислотном анализаторе марки ААА-Т333 (Чехия). Разделение аминокислот проводили на аналитической колонке, заполненной катионообменной смолой «Ostion LGFA» со ступенчатым элюированием тремя натрий-цитратными буферными растворами с различным значением pH (3,50; 4,25; 9,50).
Таблица 1 Аминокислотный состав коллагеновых продуктов, мг/100 г
|
Аминокислоты |
Продукт модификации жилок и сухожилий КРС |
Коллагеновые массы из сухожилий КРС [1] |
Коллаген дермы шкур |
|
КРС [1] |
|||
|
Аспарагиновая кислота |
6,16 |
6,26 |
6,95 |
|
Треонин |
2,06 |
1,96 |
2,26 |
|
Серин |
2,86 |
2,96 |
4,27 |
|
Глутаминовая кислота |
9,73 |
9,79 |
11,16 |
|
Пролин |
11,1 |
13,1 |
11,37 |
|
Оксипролин |
12,82 |
10,82 |
12,83 |
|
Глицин |
12,03 |
6,03 |
26,57 |
|
Аланин |
6,53 |
6,43 |
10,32 |
|
Валин |
2,08 |
1,98 |
2,46 |
|
Метионин |
1,44 |
1,54 |
0,97 |
|
Изолейцин |
2,66 |
2,86 |
3,73 |
|
Лейцин |
2,11 |
2,21 |
1,83 |
|
Тирозин |
0,91 |
0,85 |
0,99 |
|
Фенилаланин |
2,51 |
2,35 |
2,35 |
|
Гистидин |
1,32 |
1,22 |
0,7 |
|
Лизин |
5,26 |
5,42 |
3,96 |
|
Аргинин |
9,3 |
9,1 |
8,22 |
|
Тирозиновый показатель |
14,09 |
12,7 |
12,9 |
SDS-электрофорез коллагеновых фракций проводили на приборе вертикального электрофореза (VE-1M, ООО «Биоклон») по методу Лэммли. Маркерами служили: бычий сывороточный альбумин (Mr = 67 кDa); трипсин, выделенный из поджелудочной железы крупного рогатого скота (Mr = 24 кDa); лизоцим, выделенный из яичного белка (Mr = 14,6 кDa).
Иммобилизацию ДДС на белковых носителях проводили в условиях: рН = 9, продолжительность 2-4 ч., температура 18-20 оС.
Построение гипотетической пространственной модели взаимодействия продуктов биомодификации коллагеновых белков и селена в форме диметилдипиразолилселенида осуществляли с использованием квантово-химической и молекулярно-динамической программы HyperChem Release 8.0 [6].
На первом этапе модификации коллагенсодержащее сырье подвергали ферментной обработке препаратом «Коллагеназа пищевая» (производитель - ЗАО «Биопрогресс», г. Щелково Московской обл.). Выбор данного ферментного препарата основан на оптимуме значения pH для проявления его максимальной активности, близкой к уровню рН мясного сырья, наличия его промышленного производства, а также высокого сродства коллагенсодержащих субстратов. Гидролиз проводили в течение четырех часов при дозировке ферментного препарата 0,05 % к массе сырья. В процессе ферментной обработки происходит существенная трансформация белковых фракций сырья, с увеличением количества ионогенных групп по месту разрыва водородных и пептидных связей в структуре белковых молекул.
Установлено, что биомодификация коллагенсодержащих субстратов по использованной схеме приводит к увеличению содержания свободных аминокислот в 5 раз по сравнению с контрольным образцом. В составе идентифицируемых аминокислот после ферментной обработки наблюдается значительное возрастание в 21,3; 25,7 и 16,5 раз пролина, оксипролина и глицина, соответственно, что характерно для деградированного коллагена.
Поскольку ДДС представляет собой органическую форму селена, для него характерно разнообразие типов селенидов, причем химическую связь в них можно считать ковалентно-металической с вкладом определенной доли ионной связи. Селен ведет себя по аналогии с серой и это связано с его расположением в Периодической системе. Исходя из электронного строения, селен принимает на себя свободные электроны функциональных групп аминокислот и образует донорно-акцепторную связь в результате взаимодействия селена с пептидными фрагментами коллагена (рис. 1).
Рисунок 1. Схема взаимодействия ДДС и белковых молекул
Иммобилизация ДДС на продуктах биомодификации коллагена происходит в щелочной среде. Селен в молекуле ДДС связан ковалентной связью, а с пептидами - донорно-акцепторной. Иммобилизация осуществляется с участием функциональных групп полярной части молекулы (-СОО), т.е. полярная часть модифицируется и оказывается экранированной для взаимодействующих с лигандом молекул.
Используя результаты анализа аминокислотного состава продуктов биомодификации жилок и сухожилий КРС, а также известные результаты (А. А. Зайдес) рентгенофазового анализа, характерного для альфа (1) спирали коллагена последовательности аминокислотных остатков - глицин-пролин-лизин-глицин-пролин-аланин-глицин-глутамин-аргинин [2], мы с помощью имеющихся алгоритмов (программа HyperChem версии 8,0) осуществили геометрическую оптимизацию данного участка альфа (1) спирали коллагена, изображенного на рисунке 2.
Рисунок 2. Конфигурация пептидного участка коллагена
В результате разделения исследованного раствора коллагена методом SDS-электрофореза в ПААГ в препарате было выявлено 4 основные белковые фракции (табл. 2).
Таблица 2 Относительная электрофоретическая подвижность, молекулярная масса и массовая доля белковых фракций
|
Белок |
Rf, отн.ед. |
lg, Mr |
Молекулярная масса, Da |
Массовая доля фракций, % |
|
1 |
0,101 |
2,005 |
101100 |
18,4 |
|
2 |
0,217 |
1,950 |
89100 |
19,1 |
|
3 |
0,307 |
1,918 |
82700 |
22,3 |
|
БСА |
0,246 |
1,826 |
67000 |
|
|
4 |
0,512 |
1,706 |
50800 |
40,1 |
|
Трипсин |
0,650 |
1,380 |
24000 |
|
|
Лизоцим |
0,830 |
1,158 |
14400 |
|
Исходя из литературных данных (А. А. Зайдес, 1968; 1972), можно считать, что самая легкая фракция 4 состоит в основном из альфа-компонентов, представляющих собой отдельные одинарные цепи первоначальной трехспиральной макромолекулы коллагена, фракции 2 и 3 - из бета-компонентов - димеров, образующихся за счет внутримолекулярного скрепления альфа-компонентов. Наиболее тяжелая фракция 1 представлена различными типами гамма-компонентов коллагена, состоящими из трех отдельных цепей и представляющими собой тримеры альфа-компонентов, принадлежащих различным молекулам и скрепленных межмолекулярными связями.
Результаты исследований показали, что модифицированный нами коллаген состоит из низкомолекулярных фракций. Поэтому для моделирования пространственной структуры продуктов иммобилизации использовали пептидный участок a (1) коллагена со следующей последовательностью аминокислотных остатков: глицин-пролин-лизин-глицин-пролин-аланин-глицин-глутамин-аргинин.
Используя результаты компьютерного моделирования структуры пептидных участков коллагена, а также данные, полученные методами рентгенофазового анализа [1, 2], и известные данные о структуре диметилдипиразолилселенида, нами построена гипотетическая модель взаимодействия с ним продуктов модификации жилок и сухожилий КРС аминокислот, изображенная на рисунке 3. Свидетельством корректности геометрической оптимизации являются расчетные характеристики полученной модели. Величина суммарной энергии исследуемой модели являлась достаточно малой величиной (28,791 ккал/моль), среднеквадратичный градиент был приближен к нулевому значению (0,099 ккал/(Å×моль)), что свидетельствует об эффективно выполненной процедуре минимизации потенциальной энергии и сбалансированности энергетических свойств системы.
Рисунок 3. Гипотетическая модель взаимодействия диметилдипиразолилселенида с глицином и аргинином в структуре продуктов гидролиза коллагена
Таким образом, из полученной модели ковалентной иммобилизации ДДС с пептидным участком коллагена видно, что в процессе участвуют донорно-акцепторные связи между гидрофильными аминокислотами и селеном в структуре молекулы диметилдипиразолилселенида. Полученные данные могут быть использованы при прогнозировании свойств, проектируемой пищевой добавки, с биопротекторными свойствами.
Рецензенты:
- Артюхов В. Г., д.б.н., профессор, декан биолого-почвенного факультета, зав. кафедрой биофизики и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет», Россия, г. Воронеж.
- Корнеева О. С., д.б.н., профессор, зав. кафедрой микробиологии и биохимии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий», г. Воронеж.