В настоящее время остается актуальной проблемой поиск лекарственных веществ, сочетающих эффективное повреждающее действие на малигнизированные клетки с низкой токсичностью в отношении нормальных тканей. В связи с этим представляется перспективным изучение веществ, принадлежащих к алкалоидам трополонового ряда, наиболее известным представителем которых является колхицин. Имеются сведения об избирательной токсичности указанных факторов в отношении опухолевой ткани, продемонстрированной на линиях различных нормальных и малигнизированных клеток [1–3]. Это указывает на возможное преимущество рассматриваемых соединений по сравнению с препаратами платины, оказывающими, как известно, выраженное токсическое действие на здоровые ткани [4]. Представляется целесообразным проведение всестороннего изучения эффектов перспективных соединений трополонового ряда, одним из начальных этапов которого является определение их токсичности в экспериментах in vivo. В связи с этим интерес вызывает новое вещество в ряду 2-хинолин-2-ил-производных 1,3-трополона – 2-(6,8-диметил-5-нитро-4-хлорхинолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополон. Ранее нами в экспериментах in vitro была продемонстрирована его противоопухолевая активность в отношении клеток линии рака легкого A549. При этом минимальная ингибирующая концентрация данного соединения оказалась в 18 раз ниже по сравнению с соответствующим показателем для цисплатина [5]. Дальнейшее изучение биологической активности нового фактора предусматривало оценку его эффектов в широком диапазоне доз, способных поддерживать рост ксенографтов злокачественных опухолей человека, для определения токсичности в экспериментах на иммунодефицитных животных.
Целью исследования явилось изучение влияния 2-(6,8-диметил-5-нитро-4-хлорхинолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополона при однократном введении в трех разных дозах, отличающихся от наименьшей из них в 10 и 100 раз, на состояние иммунодефицитных мышей.
Материал и методы исследования
Исследуемое соединение 2-(6,8-диметил-5-нитро-4-хлорхинолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополон (далее – трополон) было синтезировано в Научно-исследовательском институте физической и органической химии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный федеральный университет» и представляло собой порошок светло-желтого цвета. Структурная формула вещества приведена на рисунке.
Структурная формула 2-(6,8-диметил-5-нитро-4-хлорхинолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополона
Эксперимент проводили на 20 половозрелых самцах мышей линии Balb/c Nude весом 25,5–27,5 г. Животные были распределены на 4 группы по 5 самцов в каждой. Исследуемое соединение оказалось нерастворимым в воде. В связи с этим в качестве носителя использовали 1%-ный крахмальный гель. Таким образом, трополон вводили животным в форме суспензии. Суспензию готовили ex tempore и вводили каждому животному из основных групп с помощью зонда в объеме 0,3 мл. Мыши контрольной группы получали 1%-ный крахмальный гель в том же объеме. Три основные группы мышей различались дозой вещества, получаемого per os однократно: соответственно 0,0055 (1-я группа), 0,055 (2-я группа) и 0,55 мг/г (3-я группа). Изучение действия трополона в более высокой дозе – 5,5 мг/г – было затруднено в связи с невозможностью суспендирования необходимого количества вещества в регламентированном для введения лабораторным мышам объеме геля (0,3 мл). Наименьшая из указанных доз была выбрана на основе сведений о дозах хиноктиола (известного соединения трополонового ряд), эффективных в отношении подкожных ксенографтов аденокарциномы рака легкого человека Н1975 у мышей NOD-SCID [6].
Для оценки эффектов исследуемого соединения у мышей линии Balb/c Nude при его однократном приеме использовали такие показатели, как динамика веса, особенности поведения и дыхания, биохимические и цитологические показатели крови, макрокартина внутренних органов при некропсии. Так, после однократного введения исследуемого трополона в течение 14 последующих дней проводили ежедневный осмотр мышей с оценкой поведения, позы, частоты дыхания. Массу тела определяли на 7-е и 14-е сутки. По прошествии 14 суток животных подвергали эвтаназии путем дислокации шейных позвонков. Проводили забор крови и некропсию. При некропсии контролировали наличие выпота в брюшной полости, следов исследуемого вещества в желудке и кишечнике и состояние внутренних органов.
Для оценки гематологических и биохимических показателей использовали гемоанализатор «Exigo EOS vet» (Boule Medical A.B., Швеция) и биохимический анализатор VetScanVS2 (ABAXIS Inc., Германия). Как известно, базовые биохимические и цитологические показатели крови позволяют провести комплексную оценку функций различных органов и систем. При этом токсическое действие лекарственных и иных факторов, как правило, сопровождается снижением уровня общего белка и повышением уровня целого ряда других показателей – билирубина, печеночных трансаминаз, щелочной фосфатазы, мочевины и креатинина [7]. Умеренное снижение содержания креатинина и мочевины в сыворотке крови, как правило, не имеет диагностического значения.
При статистическом анализе результатов оценивали средние значения и вариабельность показателей (коэффициент вариации, cv), для определения межгрупповых различий использовали критерий Вилкоксона–Манна–Уитни и t-критерий Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
Изучение изменений в организме экспериментальных животных не выявило выраженных признаков токсического действия трополона на уровне исследованных показателей при его применении в указанных дозах. В ходе некропсии у большинства мышей не было отмечено патологических изменений цвета кожи и слизистых оболочек, выпота в брюшной полости и следов вещества в желудке и кишечнике. У двух мышей из группы 2 наблюдались одиночные очаговые кровоизлияния в средней доле печени до 1 мм в диаметре. В группе 3 была отмечена гиперемия печени у двух самцов и очаговое кровоизлияние в легких у одной особи. Возможно, выявленные изменения могут быть следствием проведения процедуры эвтаназии, поскольку у всех этих животных при дальнейшем анализе не было обнаружено заметных отклонений в значении биохимических и цитологических показателей крови по сравнению с другими животными тех же групп. При изучении динамики веса мышей незначительное снижение данного показателя к концу периода наблюдений было отмечено только у одной особи из группы 3. У остальных животных, напротив, наблюдалось увеличение веса к концу эксперимента на 0,5–2 г по сравнению с исходными значениями. При этом наиболее выраженным такое увеличение было в контрольной группе и группе 1, которые статистически значимо отличались по данному показателю от группы 3, включавшей мышей, получивших вещество в максимальной исследованной дозе 0,55 мг/г (табл. 1).
Таблица 1
Изменение веса и биохимических показателей крови мышей Balb/c Nude
на 14-е сутки после однократного приема
2-(6,8-диметил-5-нитро-4-хлорхинолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополона
Группа |
Увеличение веса, г |
Белок, мг/дл, (cv) |
Мочевина, мг/дл, (cv) |
Креатинин мг/дл, (cv) |
Глюкоза, мг/дл, (cv) |
АЛТ, ед/л (cv) |
ЩФ, ед/л, (cv) |
Контроль |
1,7±0,14◘ |
5,2±0,1 (4%) |
23,0±1,8● (16%) |
0,36±0,08 (47%) |
249±17 (13%) |
275±86 (62%) |
0 |
1 |
1,6±0,11◘ |
4,7±0,5 (21%) |
18,0±1,1*◘ (12%) |
0,30±0,09 (58%) |
232±23 (20%) |
148±53 (71%) |
6,8±2,0*◘ (59%) |
2 |
1,3±0,29 |
6,1±0,1*●◘ (3%) |
19,6±0,3*◘ (3%) |
0,22±0,03* (22%) |
163±8*● ◘ (10%) |
62±27*◘ (88%) |
33,6±8,2*●◘ (48%) |
3 |
0,8±0,38*● |
5,2±0,1 (5%) |
23,0±1,8● (16%) |
0,31±0,09 (67%) |
245±19 (15%) |
278±85 (61%) |
менее 5● |
Примечание: * – отличается от значений в контрольной группе, p<0,01; ● – отличается от значений в группе 1, p<0,01, ◘ – отличается от значений в группе 3, p<0,01; критерий Вилкоксона–Манна–Уитни, t-критерий Стьюдента.
Биохимические показатели крови (табл. 1) имели ряд межгрупповых различий, свидетельствовавших о дозозависимом влиянии исследуемого соединения на организм мышей. При этом во всех трех основных группах не было отмечено повышения уровней мочевины, креатинина, аланинтрансферазы (АЛТ) и билирубина по сравнению с этими показателями в контрольной группе. Как уже было указано, данное обстоятельство могло отражать отсутствие значительного токсического влияния на организм экспериментальных животных трополона в исследованных дозах. Группа 1, включавшая мышей, получивших вещество в минимальной из исследованных доз (0,0055 мг/г), характеризовалась сниженным содержанием мочевины и наличием активности щелочной фосфатазы (ЩФ), отсутствовавшей у особей контрольной группы. Наиболее выраженные отличия биохимических показателей крови от контрольных значений наблюдались у мышей в группе 2, которые получали исследуемое соединение в промежуточной дозе 0,055 мг/г. У животных указанной группы были отмечены наиболее высокое содержание общего белка, сниженный уровень мочевины и креатинина, минимальное содержание АЛТ и глюкозы при максимальной активности ЩФ, кратно превышавшей активность данного фермента в группах 1 и 3. В группе 3, в отличие от группы 2, отличия биохимических показателей от контрольных значений были выражены в наименьшей степени и проявились только в наличии активности ЩФ, отсутствовавшей у мышей контрольной группы (табл. 1).
Перечисленные межгрупповые различия могли указывать на направленность метаболических и иных сдвигов в организме мышей Balb/c Nude под влиянием изучаемого трополона, использованного в разных дозах. Отсутствие заметных изменений биохимических показателей крови по сравнению с контрольными значениями в случае применения данного вещества в максимальной дозе (группа 3) может свидетельствовать об отсутствии выраженного токсического влияния данного соединения у этих животных. Это позволяет усомниться в наличии токсического действия при его использовании в более низких дозах, несмотря на статистически значимые сдвиги некоторых из рассматриваемых показателей в группах 1 и 2. По нашему мнению, в группе 2 сочетание повышенного уровня общего белка со сниженным содержанием мочевины, глюкозы, креатинина и АЛТ при крайне низкой вариабельности уровня белка и мочевины (cv=3%, табл. 1), имеющих прямую метаболическую связь, могло указывать на уменьшение интенсивности катаболических процессов при однократном приеме трополона в промежуточной дозе. Представляется маловероятным, что на фоне перечисленных сдвигов и увеличения веса животных к концу эксперимента значительное повышение активности ЩФ в данной группе могло отражать развитие структурных нарушений в печени и/или костной ткани, с которыми часто связывают резкое повышение активности этого фермента в крови. Более вероятным в данном случае представляется компенсаторное и/или протекторное значение отмеченного сдвига активности ЩФ. На такую возможность указывают данные литературы о защитном действии кишечного пула ЩФ по отношению к естественной микробиоте, о способности фермента активизировать иммунные процессы и положительном влиянии дополнительного введения ЩФ при осложнениях интенсивной антибиотикотерапии [8–10]. В группе 1 при использовании трополона в минимальной дозе потребность в протекторном влиянии ЩФ, очевидно, была ниже, чем в группе 2, что и обусловило менее выраженную активизацию рассматриваемого фермента. Уменьшение уровня мочевины у мышей данной группы так же, как и в предыдущем случае, могло отражать снижение интенсивности белкового обмена. Таким образом, некоторая активизация фермента в группе 1 и весьма заметное повышение его активности в группе 2 на фоне признаков оптимизации метаболических процессов могли отражать положительные регуляторные изменения в организме иммунодефицитных мышей, обусловленные приемом исследуемого вещества.
По нашему мнению, в пользу такого предположения свидетельствуют и результаты анализа гематологических показателей животных исследованных групп, представленные в таблице 2. Обращает на себя внимание сниженное содержание лейкоцитов и мононуклеаров в крови животных всех исследованных групп по сравнению с показателями у иммунокомпетентных мышей линии Balb/c [11]. Как видно из таблицы 2, введение трополона не привело к изменениям общего числа лейкоцитов, а также содержания тромбоцитов и гемоглобина в крови иммунодефицитных мышей через 2 недели после его однократного приема. В то же время в конце эксперимента наблюдались заметные изменения в мононуклеарном составе крови, общим итогом которых явился статистически значимый сдвиг соотношения содержания лимфоцитов и моноцитов в сторону лимфоцитов. При этом так же, как и в случае биохимических показателей, соответствующие изменения были отмечены, прежде всего, в группах 1 и 2 (табл. 2). Так, в группе 1 наблюдалось увеличение относительного числа лимфоцитов при снижении абсолютного и относительного числа моноцитов. В группе 2 было отмечено увеличение абсолютного и относительного числа лимфоцитов при снижении относительного числа моноцитов. В результате отношение относительного числа лимфоцитов к относительному числу моноцитов (лф%/мон%) при введении исследуемого соединения в минимальной и промежуточной дозе увеличилось по сравнению со значением в контроле соответственно в 1,7 и 2,1 раза (табл. 2).
Выбор процентного (а не абсолютного) содержания мононуклеров в качестве компонентов соотношения, характеризующего состояние животных, был обусловлен известными сведениями об информативности относительных гематологических показателей как характеристик интегральных адаптационных процессов [12, 13]. Показатели такого рода, как правило, отличаются большей стабильностью по сравнению с абсолютными характеристиками. Это, в частности, находит отражение и в уровне их вариабельности. Так, коэффициенты вариации относительного числа лимфоцитов и моноцитов у мышей исследованных групп были заметно ниже (в 1,3–7 раз) коэффициентов вариации абсолютного количества этих мононуклеаров (табл. 2). Правомерность сделанного выбора подтверждается результатами анализа гематологических характеристик у животных, получивших изучаемое вещество в максимальной из исследованных доз. В группе 3, отличавшейся наибольшей вариабельностью гематологических показателей, не было отмечено статистически значимых отклонений количественных характеристик мононуклеаров крови от контрольных значений. Тем не менее отношение лф%/мон% в группе 3, так же как и в двух других основных группах, оказалось выше, чем у мышей в контроле (табл. 2). Это может свидетельствовать об иммунотропном действии трополона и отражать его способность активизировать лимфоцитарный компонент иммунной системы животных с Т-клеточным дефицитом.
Таблица 2
Гематологические показатели у мышей линии Balb/c Nude через 14 дней после однократного введения
2-(6,8-диметил-5-нитро-4-хлорхинолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополона
Группа |
Гемоглобин |
Тромбоциты |
Лейкоциты, 109/л, (cv) |
Лимфоциты |
Моноциты |
Лф%/Мон%, (cv) |
||
109/л, (cv) |
%, (cv) |
109/л, (cv) |
%, (cv) |
|||||
Контроль |
147±9 (12%) |
381±163 (86%) |
2,7±0,5 (38%) |
1,16±0,2 (36%) |
45,4±1,2 (5%) |
0,58±0,11 (37%) |
17,8±1,2 (13%) |
2,58±0,14 (11%) |
1 |
136±8 (12%) |
380±73 (38%) |
3,0±0,6 (37%) |
1,60±0,35 (43%) |
54,6±3,0* (11%) |
0,42±0,07* (31%) |
12,4±0,8* (13%) |
4,46±0,30* (13%) |
2 |
146±6 (8%) |
475±164 (69%) |
3,5±0,6 (36%) |
1,94±0,35*◘ (36%) |
60,0±5,0* (18%) |
0,48±0,10 (40%) |
12,3±2,1* (30%) |
5,34±1,38* (51%) |
3 |
135±14 (21%) |
494±175 (71%) |
2,5±0,6 (52%) |
1,16±0,28 (49%) |
50,3±6,8 (27%) |
0,44±0,14 (65%) |
14,0±2,1 (33%) |
3,94±0,79* (40%) |
Примечания:* – отличается от значений в контрольной группе, p<0,01; ● – отличается от значений в группе 1, p<0,01, ◘ – отличается от значений в группе 3, p<0,01; критерий Вилкоксона–Манна–Уитни, t-критерий Стьюдента.
Заключение
Физико-химические особенности 2-(6,8-диметил-5-нитро-4-хлорхинолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополона, связанные с нерастворимостью в воде и недостаточно высокой способностью к образованию суспензий с 1%-ным крахмальным гелем, обусловили ограничение диапазона исследованных доз. Это не позволило в рамках изучения острой токсичности определить максимально переносимую (МПД) и полулетальную дозу (ЛД50) данного вещества при его однократном приеме. Отсутствие выраженных признаков токсического влияния трополона при его однократном введении в дозах 0,0055, 0,055 и 0,55 мг/г определяет границы применения данного вещества для дальнейшего изучения его кумулятивных и противоопухолевых эффектов. Вызывают интерес признаки оптимизации метаболизма при использовании трополона в дозах 0,0055 и 0,055 мг/г и сдвиг соотношения относительного числа лимфоцитов и моноцитов в сторону лимфоцитов у мышей из всех основных групп. Это может указывать на иммунотропный характер влияния исследованного вещества, особенно выраженный в случае его применения в минимальной и промежуточной дозах. Поскольку исследования проводились на животных с выраженным Т-клеточным дефицитом, речь может идти о возможной активизации В- и НК-клеточного звеньев иммунной системы как одного из механизмов действия исследованного вещества трополонового ряда. Выявленные тенденции влияния 2-(6,8-диметил-5-нитро-4-хлорхинолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополона могут быть использованы для поиска эффективных режимов его применения.