Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Ревматоидный артрит (РА) — аутоиммунное заболевание, проявляющееся эрозивно-деструктивным полиартритом и системным поражением внутренних органов [1].

Ревматоидный артрит считается тяжёлым, инвалидизирующим заболеванием, частота встречаемости которого в популяции составляет около 1%. По последним эпидемиологическим исследованиям, частота данного заболевания среди населения России составляет 0,6% [2].

Мишенью РА является, прежде всего, синовиальная оболочка сустава, которая гиперплазируется, васкуляризируется, образуя специфичный «паннус». Последний внедряется в хрящевую ткань и приводит к формированию эрозий с обязательным поражением подлежащей костной ткани [3].

В состав синовиальной оболочки, помимо синовиоцитов, входят лимфоциты, моноциты, тучные и плазматические клетки. Моноциты, синтезируя интерлейкин 1,6 (ИЛ-1, ИЛ-6), фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α) и другие цитокины, относящиеся к провоспалительным, индуцируют и поддерживают воспаление.

Иммунные комплексы, продуцируемые в синовиальной оболочке, активируют компоненты комплемента, это в свою очередь приводит к выработке факторов хемотаксиса, которые адгезируют лейкоциты к эндотелию венул. Таким же эффектом обладают вышеперечисленные провоспалительные интерлейкины, синтезируемые макрофагами синовии суставов. ФНО-α , С5а, лейкотриен В4 и ИЛ-8, а также гистамин, синтезируемый тучными клетками синовиальной оболочки, привлекают нейтрофилы в синовиальную жидкость из сосудистого русла. Нейтрофилы, попав в полость сустава, поглощают иммунные комплексы, что сопровождается выбросом свободных радикалов кислорода, а значит поддерживается воспалительная реакция в суставе. Моноциты крови и тканевые макрофаги, генерируя факторы роста, стимулируют эндотелий к размножению, определяя наравне с нейтрофилами активность воспалительной реакции в синовиальной оболочке сустава [4].

Помимо механизмов клеточного иммунитета, в патогенезе РА играют значительную роль и механизмы гуморального иммунитета в виде синтеза антител (АТ) - биомаркеров заболевания. Так, В-лимфоциты продуцируют аутоантитела, прежде всего, ревматоидный фактор (РФ) и антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП), а также АТ к цитруллинированному фибриногену, цитруллинированному виментину, цитруллинированной а-энолазе, цитруллинированному коллагену II типа, АТ к RA-33 - гетерогенному ядерному нуклеопротеину А2 [5].

Различают серопозитивный и серонегативный ревматоидный артрит по наличию или отсутствию ревматоидного фактора в сыворотке крови соответственно.

Нейтрофилы и макрофаги, инфильтрирующие синовиальную оболочку сустава, поглощают ревматоидный фактор, что приводит к синтезу большого количества цитокинов и высвобождению протеолитических ферментов, усиливающих воспаление.

Изучение функциональной активности нейтрофилов и моноцитов периферической крови посредством цитохимического метода позволит дать оценку интенсивности воспалительной реакции в синовиальной оболочке и эффективности проводимой терапии.

Интерес к цитохимическому методу объясняется возможностью определять с его помощью активность ферментов в целой клеточной популяции, в отличие от возможностей стандартных биохимических исследований.

Немногочисленность работ, посвящённых изучению цитохимического профиля вышеуказанных клеток у пациентов с ревматологической патологией [6], обуславливает актуальность нашего исследования.

Цель исследования. Оценить метаболический статус нейтрофилов и моноцитов периферической крови у пациентов с ревматоидным артритом, находящихся на терапии базисными противовоспалительными препаратами.

Материалы и методы исследования.

В ревматологическом отделении ГБУЗ АО «Александро-Мариинская областная клиническая больница» было обследовано 67 пациентов с ревматоидным артритом в возрасте от 27 до 65 лет.

Критерии включения в исследование: диагноз «ревматоидный артрит», возраст от 27 до 65 лет.

Критерии исключения: острые и хронические неревматические воспалительные заболевания в стадии обострения, заболевания системы крови, острые инфекционные заболевания, злокачественные новообразования, возраст старше 65 лет.

Из 67 пациентов с ревматоидным артритом 42 пациента имели серопозитивный РА (n=42) и 25 пациентов - серонегативный РА (n=25). Контрольная группа представлена 35 здоровыми донорами. Распределение пациентов по полу и возрасту было следующим: мужчины - 12 человек (17,9%), женщины – 55 человек (82,1%) в возрасте от 27 до 65 лет. Средний возраст женщин с серопозитивным РА - 53,3 (мин. 31, макс. 65 лет), с серонегативным РА - 51,1 (мин. 27, макс. 65 лет), мужчин с серопозитивным РА – 54,8 (мин. 47, макс. 64 лет), с серонегативным РА – 44,5 лет (мин. 33, макс. 53 лет).

Все пациенты на момент исследования находились на стационарном лечении в ревматологическом отделении, уже получая БПВП (метотрексат - 31 пациент, сульфасалазин - 11 пациентов, лефлунамид - 21 пациент). В отделении пациенты также получали нестероидные противовоспалительные препараты (НПВС) и глюкокортикостероиды (ГКС). Исследование цитохимической активности ферментов нейтрофилов и моноцитов крови проводилось дважды: при поступлении в стационар и по выписке.

По клинической стадии пациенты с РА распределились следующим образом: поздняя стадия - 56,7% (серопозитивный РА - 37,3%, серонегативный РА - 19,4% пациентов), развёрнутая стадия - 43,3% (серопозитивный РА - 25,4%, серонегативный РА - 17,9%).

По рентгенологической стадии заболевания выявлено следующее. III рентгенологическая стадия диагностировалась чаще всего – в 41,7% случаев (28,3% - у пациентов с серопозитивным РА, 13,4% - с серонегативным РА). IV рентгенологическая стадия определена у 31,5% (23,9% - с серопозитивным РА, 7,6% - с серонегативным РА). II стадия выявлена у 23,8% пациентов с РА (10,4% пациентов с серопозитивным РА и 13,4% с серонегативным РА).

По степени активности заболевания получены следующие данные. И у пациентов с серопозитивным (47,8%), и у пациентов с серонегативным РА (22,4%) чаще всего выставлялась 3-я степень активности, что соответствовало индексу DAS 28 >5,1. 2-я степень активности диагностирована у 14,9% больных с серопозитивным РА и у 11,9% с серонегативным РА (DAS 28 3,2-5,1).

Большинство пациентов с РА имели ФК III (76,1%), распределение которого среди пациентов с серопозитивным и серонегативным РА не одинаково: 55,2% и 20,9% соответственно. ФК II определён у 23,9% пациентов с РА: у 16,4% пациентов с серонегативным РА и у 7,5% пациентов с серопозитивным РА.

Установлено, что у 51 пациента (76,1%) обнаружены системные проявления РА: ревматоидные узелки выявлены у 10,4%, анемия – у 19,4%, тромбоцитоз – у 14,9%, сочетание двух и более системных проявлений (обязательным являлось наличие ревматоидного васкулита) наблюдалось у 29,8% пациентов, системные проявления не выявлены у 23,9% пациентов.

Всем пациентам проводилась цитохимическая оценка ферментативной активности нейтрофилов и моноцитов. Нейтрофилы определяли в мазке из цельной крови методом Р.П. Нарциссова (1970). Выделение моноцитов проводили по методике И.С. Фрейдлин (1978).

Исследовали окислительно-восстановительную группу энзимов: сукцинатдегидрогеназу (СДГ), отражающую цикл Кребса; лактатдегидрогеназу (ЛДГ), отражающую анаэробный гликолиз; глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (Г-6-ФДГ), отражающую активность пентозо-фосфатного шунта [7].

Результаты цитохимических реакций оценивали полуколичественным методом Kaplow (1955) [8] с определением среднего цитохимического показателя (СЦП). Суть метода заключается в том, что все клеточные элементы разделяются по группам в зависимости от выраженности окраски и количества определяемого в клетке цитохимически активного вещества. Если клетки не имеют гранул, они относятся к нулевой группе. Клетки, площадь окраски которых представлена 25% цитоплазмы, или содержащие единичные гранулы, относятся к первой группе, т.е. это клетки низкой степени активности (степень «а»). Если цитоплазма клеток заполнена гранулами на 30-70%, то такие клетки относятся ко второй группе, т.е. к клеткам средней степени активности (степень «б»). Клетками третьей группы, т.е. высокой степени активности, считаются те, цитоплазма которых заполнена гранулами на 70-100% и из которых наблюдался выход гранул независимо от того, контролировалось ядро или нет (степень «в»).

Чтобы рассчитать СЦП в мазке выделяли 100 клеток (нейтрофилов или моноцитов, в зависимости от типа мазка). При этом число клеток каждой из степеней умножали на номер степени. Таким образом, для подсчёта СЦП используется формула: СЦП = а + 2б + 3в (усл. ед.).

Полученные цитохимические данные подвергались математической обработке на персональном компьютере в программе «Статистика 8». Учитывая отличное от нормального распределение признаков в группе, использовались непараметрические методы описания (Ме [LQ; UQ]), сравнения (тест Манна-Уитни, Вилкоксона), установления связи (тест Спирмена) данных. Сравнение достоверности распределения признаков в группах проводилось с помощью критерия χ². Достоверными считали различия при p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Цитохимический анализ проводили в динамике: на момент поступления в стационар и на момент выписки из стационара (через 2 недели).

В первый день поступления в стационар СЦП СДГ нейтрофилов составил 48,0 [44,0;50,0] у.е. (норма СДГ 15,02±0,02 у.е.), превышая норму в 3 раза. Все реагирующие клетки классифицировались как степень «б» (средняя степень активности). Активность ЛДГ при поступлении у больных РА превышала норму в 2,5 раза и составила 53,0 [46,0; 54,0] у.е. (норма ЛДГ 20,02±0,02 у.е.), при этом все клетки также были степени «б». СЦП Г-6-ФДГ составил 65,0 [58,0; 66,0] у.е. при норме 35,04±0,02 у.е., что превышает норму в 1,7 раза, и снова все реагирующие клетки были классифицированы как степень «б».

После курса стационарного лечения (через 2 недели) активность СДГ и ЛДГ оставалась практически неизменной (р=0,33, р=0,15 соответственно при сравнении показателей до и после курса стационарного лечения), в отношении Г-6-ФДГ отмечалось некоторое снижение активности (на 12,9%), она составила 57,0 [50,0; 59,0] у.е. (р=0,002). СЦП всех ферментов также был сформирован клетками степени «б», как и при поступлении в стационар.

В отношении моноцитов наблюдалась следующая тенденция.

При поступлении в стационар активность СДГ составляла 47,0 [41,0; 50,0] у.е. (норма СДГ 20,02±0,01 у.е.), это превысило нормальные значения в 2,1 раза. СЦП активности ЛДГ у больных с РА на момент госпитализации превышал норму в 3 раза и составил 45,0 [39,0; 47,0] у.е. (норма ЛДГ 15,16±0,04 у.е.). При норме 15,60±0,04 у.е. активность Г-6-ФДГ составила 39,0 [32,0; 40,0] у.е., что было выше нормы в 2,1 раза. СЦП активности всех трёх ферментов был представлен клетками степени «а» (низкой активности).

При выписке из стационара после курса лечения активность СДГ снизилась до 26,0 [22,0; 29,0] у.е. (р=0,003), активность ЛДГ - до 24,0 [21,0; 26,0] у.е. (р=0,001). Активность Г-6-ФДГ осталась практически неизменной (р=0,11). СЦП всех ферментов также был сформирован клетками степени «а». Все вышеуказанные данные представлены в таблице.

Динамика активности окислительно-восстановительных ферментов нейтрофилов и моноцитов крови у пациентов с РА на БПВП после курса стационарного лечения

Активность окислительно-восстановительных ферментов нейтрофилов и моноцитов крови в нашем исследовании принципиально не отличалась в зависимости от типа получаемых БПВП (р>0,05).

Также нами была проведена оценка взаимосвязей между некоторыми гематологическими показателями, величиной индекса DAS-28, который отражает активность РА, и активностью окислительно-восстановительных ферментов нейтрофилов и моноцитов крови. Выявлена положительная корреляция средней силы (r =0,6) между всеми ферментами нейтрофилов, кроме СДГ (сильная корреляция - r ⩾0,7), моноцитов и уровнем скорости оседания эритроцитов (СОЭ), DAS-28, такая же корреляция существует и между активностью ферментов только нейтрофилов и уровнем С-реактивного белка (СРБ).

Т.к. DAS-28 является отражением клинико-лабораторной активности РА, то вышеуказанные корреляционные связи указывают на чёткую зависимость между активностью заболевания и активностью ферментов нейтрофилов и моноцитов крови, т.е. чем выше DAS-28 (активность заболевания), тем выше уровень ферментов нейтрофилов и моноцитов периферической крови.

Итак, в отношении нейтрофилов мы наблюдали отсутствие динамики активности ЛДГ и СДГ, но небольшую тенденцию к нормализации активности Г-6-ФДГ, в отношении которой до лечения наблюдалась наибольшая активность. СЦП всех клеток сформирован клетками средней степени активности как до, так и после лечения. Это свидетельствует о том, что по окончании курса лечения (через 2 недели) не достигается оптимальное цитохимическое равновесие внутриклеточных ферментов нейтрофилов периферической крови, т.е. истинной ремиссии не наблюдается, несмотря на то что у 21% пациентов по выписке из стационара на основании показателей DAS-28 была достигнута клинико-лабораторная ремиссия РА (примечательно также, что после курса стационарного лечения в рамках расчёта DAS-28 пациенты оценивали уровень боли по визуально-аналоговой шкале (ВАШ) как «слабый» или «полное отсутствие боли», т.е. субъективная оценка своего состояния пациентом: «удовлетворительно» или «хорошо»). Несколько активнее меняется функциональная активности моноцитов: явная тенденция к нормализации относительно СДГ и ЛДГ, Г-6-ФДГ остаётся неизменной. Но СЦП всех клеток изначально сформирован клетками низкой степени активности как до, так и после курса стационарного лечения. Нельзя не отметить, что несмотря на очевидное повышение активности внутриклеточных ферментов нейтрофилов и моноцитов крови до курса стационарного лечения, их активность все же значительно ниже тех цифр, которые мы регистрировали у аналогичной группы пациентов, не получавших до стационарного лечения БПВП (СЦП активности СДГ, ЛДГ, Г-6-ФДГ в нейтрофилах 96, 129, 156±0,02 у.е. соответственно и в моноцитах 92±0,01 у.е., 104±0,04 у.е., 122±0,04 у.е., р=0,0001).

Полученные данные свидетельствуют также о том, что на момент обострения заболевания усиление уже имеющейся БПВП приёмом НПВС и ГКС целесообразно ввиду однозначного влияния последних на стабилизацию цитохимического профиля нейтрофилов и моноцитов крови. Обращает на себя внимание и тот факт, что СЦП всех клеток не был представлен клетками высокой степени активности. Это обусловлено тем, что БПВП, в частности те, которые принимала наша группа пациентов, способны накапливаться в клетках ретикулоэндотелиальной системы и влиять на процессы фагоцитоза и презентации антигенов [9].

Таким образом, дальнейшее изучение функциональной активности нейтрофилов и моноцитов периферической крови у пациентов с РА позволит разработать диагностические алгоритмы оценки патохимической активности воспалительного процесса, а также эффективности проводимой терапии.