Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,682

MOLECULAR AND GENETIC PREDICTORS OF IMMUNE RESPONSE IN LATENT SYPHILIS AND SERORESISTANT

Minasyan M.M. 1 Barycheva L.Yu. 1 Aksenova L.Y. 2 Annenkova T.I. 1
1 FGBO VO Stavropol state medical university Health Ministry of Russian Federation
2 .Federal State Institution of Healthcare "Stavropol anti-plague Institute of Rospotrebnadzor (Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing)
Большое клиническое значение в современной медицине является поиск биологических маркеров заболевания, которые могут использоваться для оценки потенциального риска его развития и реализации его клинических фенотипов. Цель исследования: определение клинико-патогенетического значения генного полиморфизма рецепторов врожденного иммунитета в развитии скрытого и серорезистентного сифилиса. В исследование включено 100 человек с сифилитической инфекцией, в том числе 35 – с ранним скрытым сифилисом, 24 – с поздним скрытым сифилисом и 41 пациент с серорезистентным сифилисом. Установлено, что полиморфизмы генов врожденного иммунитета TLR2 Arg753Gln (rs5743708), TLR6 Ser249Pro (rs5743810) ассоциированы с развитием скрытого и серорезистентного сифилиса у пациентов Юга России. Показано, что высокий риск развития скрытых форм сифилиса и сифилиса с серорезистентностью определяется у носителей генотипов TLR2-753 Gln/Gln, TLR2-753 Arg/Gln, TLR6-249 Ser/Ser и аллеля Gln/753. Протективными свойствами обладают гомозиготные генотипы TLR2-753 Arg/Arg, TLR6 –249 Pro/Pro и аллель Pro/249. Развитие серорезистентности при сифилисе ассоциировано с генотипами 753 Arg/Gln, 753 Gln/Gln, 249 Pro/Pro и наличием аллелей Gln/753, Pro/249.
Search for biological markers of disease that can be used to assess the potential risk of its development and implementation of clinical phenotypes is оf great clinical value in modern medicine. The aim of the study was to determine the clinical and pathogenetic significance of genetic polymorphisms of innate immunity receptors in the development of serum resistant and latent syphilis. The study included 100 people with syphilis infection, including 35 – early latent syphilis, 24 – with late latent syphilis and 41 patients with serum resistant syphilis. It is established that polymorphisms in genes of innate immunity TLR2 Arg753Gln (rs5743708), TLR6 Ser249Pro (rs5743810) are associated with the development of the latent and serum resistant syphilis at patients in Southern Russia. It was shown that the high risk of latent forms of syphilis and syphilis with serous resistance is determined in carriers of the genotypes TLR2-753 Gln/Gln, TLR2-753 Arg /Gln, TLR6-249 Ser /Ser and Gln /753 allele. The homozygous genotypes TLR2-753 Arg/Arg, TLR6-249 Pro/Pro and allele Pro/249 possess protective properties. The development of sero-resistance in syphilis is associated with genotypes of 753 Arg/Gln, 753 Gln/Gln, 249 Pro/Pro and the presence of Gln/753, Pro/249 alleles.
innate immunity receptors
genetic polymorphism
late latent syphilis
early latent syphilis
serum resistant syphilis

Несмотря на снижение заболеваемости сифилисом в Российской Федерации, ее уровень по-прежнему остается высоким и превышает показатели развитых европейских стран и США [1; 2]. Особенности сифилитической инфекции в последнее десятилетие определяются увеличением персистирующих скрытых и поздних форм заболевания, частым формированием серорезистентности, сложностями диагностики и терапии вследствие неоправданно широкого использования антибактериальных средств, приводящих к формированию иммунной компрометированности и изменяющих клинику и течение инфекционного процесса [1-4].

Перспективным направлением современной медицины является поиск информативных биомаркеров персистенции инфекции и прогрессирования заболевания, позволяющих прогнозировать сценарий инфекционного процесса и своевременно осуществлять терапевтические мероприятия [5].

Актуальными для изучения при сифилисе являются рецепторы врожденного иммунитета (TLR) [6-9]. Установлено, что нарушение структуры и функции рецепторов TLR сопровождается снижением продукции ключевых интерлейкинов, обеспечивающих интенсивность реакций врожденного и адаптивного иммунитета, что лежит в основе развития инфекционного процесса [7-9].

Частоты полиморфных генов, влияющих на реализацию иммунного ответа, остаются постоянными в течение жизни и могут использоваться в качестве предикторов развития заболевания и реализации его клинических фенотипов [5].

Цель исследования: определение клинико-патогенетической роли TLR-рецепторов в развитии скрытого сифилиса и формировании серорезистентности.

Материал и методы исследования

Иммуногенетические исследования выполнены у 100 человек с сифилитической инфекцией, восточнославянской популяции Юга России, находившихся под наблюдением в Ставропольском краевом клиническом кожно-венерологическом диспансере (СККВД). В группу I включены 35 пациентов с ранним скрытым сифилисом, в группу II – 24 пациента с поздним скрытым сифилисом, в группу III – 41 пациент с сифилисом с серорезистентностью.

Средний возраст у пациентов в группе I составил 35,2±1,8 года, в группе II – 40,9 ±2,09 года, в группе III – 41,1 ±1,74 года.

Контрольную группу составили 50 здоровых жителей восточнославянской популяции Южного региона России, средний возраст – 37,1±1,44 года. Группы пациентов, больных сифилисом и контрольная группа имели близкий социально-экономический статус.

Типирование SNPs TLR2 и TLR6 осуществляли методом ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) с выполнением амплификации интересующего участка и последующей обработкой эндонуклеазой рестрикции. В работе использовали диагностические наборы для выявления полиморфизмов в геноме человека методом полимеразной цепной реакции «SNP-экспресс» ООО НПФ «Литех», г. Москва.

Амплификацию проводили с помощью многоканального амплификатора «Терцик» (ООО «ДНК-Технология», Россия). Разделение продуктов амплификации выполняли в 3%-ном агарозном геле методом горизонтального электрофореза с использованием комплекта оборудования BioRad Laboratories, США.

Для статистического анализа данных использовали пакет программ Attestat 10.5.1., Statistica SPSS, «Калькулятор для расчета статистики».

Достоверность различий в частотах аллельных вариантов и генотипов оценивалась с помощью критерия χ2 Пирсона, при множественных сравнениях – с помощью критерия χ2 с поправкой Йетса. Степень риска развития событий оценивали по величине отношения шансов (OR) с расчетом доверительного интервала CI.

Результаты исследования и их обсуждение

При изучении аллелей полиморфизма 753 Arg/Gln (rs5743708) гена TLR2 отмечено частотное преобладание дикого аллеля Arg/753 в гомозиготном состоянии как у больных сифилисом (71%), так и у здоровых респондентов (94%) (табл. 1).

Таблица 1

Распределение частот аллелей и генотипов TLR2 у больных со скрытым сифилисом и сифилисом с серорезистентностью

Ген

Аллели

/генотип

Сифилис

Контрольная группа

χ2

OR (95% CI)

 

 

TLR2

-753

 

Arg

122/200 (0,61)

97/100 (0,97)

p<0,01

0,05 (0,015-0,158)

Gln

78/200 (0,39)

3/100 (0,03)

p<0,01

20,7 (6,33-67,5)

Arg/Arg

71/100 (0,71)

48/50 (0,96)

p<0,01

0,10 (0,02-0,45)

Arg/Gln

8/100 (0,08)

1/50 (0,02)

 

4,26 (0,52-35,1)

Gln/Gln

21/100 (0,21)

1/50 (0,02)

p<0,01

13,0 (1,70-90,9)

p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 Пирсона),

OR - отношение шансов, CI - 95% доверительный интервал.При этом у пациентов со скрытым сифилисом и сифилисом с серорезистентностью установлено существенное увеличение распространенности редкого аллеля Gln/753 – 78/200 (0,39) (OR=20,7, 95% CI:6,33-67,6) по сравнению со здоровыми донорами – 3/100 (0,03). Следует отметить, что гомозиготное состояние мутантного аллеля Gln/753 у больных с сифилисом встречалось в 10 раз чаще, чем у здоровых респондентов (0, 21 и 0,02, p<0,01).

Выявлено существенное увеличение риска развития скрытого и серорезистентного сифилиса у респондентов гомозиготного Gln/Gln и гетерозиготного Arg/Gln генотипов TLR2 –753 Arg/Gln (rs5743708). Относительный риск развития заболевания у носителей Gln/Gln составил 13,0 (95% CI:1,70-90,0), у резидентов Arg/Gln – 4,26 (95% CI:0,52-35,1).

У пациентов с различными клиническими вариантами заболевания установлено достоверное уменьшение частоты преобладающего в популяции аллеля Arg/753 и увеличение мутантного – Gln/753 (табл. 2).

Риск развития заболевания у обладателей Gln/753 при раннем скрытом сифилисе составил 8,1 (95% CI:2,23-29,4), при позднем скрытом – 7,46 (95% CI:1,92-23,0), у пациентов с формированием серорезистентности увеличивался в десятки раз – 65,8 (95% CI:19,1-227,1).

Среди больных со скрытым и серорезистентным сифилисом установлено уменьшение частоты встречаемости гомозигот по основному аллелю (Arg/Arg) по сравнению с контрольной группой. У больных сифилисом с формированием серорезистентности определялось частотное преобладание гомозигот по мутантному аллелю Gln/Gln (0,27 и 0,02, p<0,05).

Таблица 2

Распределение частот аллелей и генотипов гена TLR2 у больных со скрытым сифилисом и сифилисом с серорезистентностью

Аллели

/генотип

Ранний скрытый сифилис (I)

n=35

Поздний скрытый сифилис (II)

n=24

Серорезис-тентный сифилис (III)

n=41

Контрольная

группа

(IV)

n=50

χ2

OR (95% CI)

Arg

56/70 (0,80)

39/48 (0,81)

55/82 (0,67)

97/100 (0,97)

pI-IV <0,01

pII-IV <0,01

pIII-IV<0,01

0,12 (0,03-0,45)1

0,13 (0,03-0,5202

0,02 (0,004-0,05)3

Gln

14/70 (0,20)

9/48 (0,19)

27/82 (0,33)

3/100 (0,03)

pI-IV <0,01

pII-IV <0,01

pIII-IV<0,01

8,1 (2,23-29,4)1

7,46 (1,92-23,0)2

65,8 (19,1-227,1)3

Arg/Arg

27/35 (0,77)

19/24 (0,79)

25/41 (0,61)

48/50 (0,96)

pI-IV <0,05

pII-IV <0,05

pIII-IV<0,05

0,14 (0,03-0,71)1

0,16 (0,03-0,89)2

0,07 (0,01-0,31)3

Arg/Gln

2/35 (0,06)

1/24 (0,04)

5/41 (0,12)

1/50 (0,02)

 

2,97 (0,26-34,1)1

2,13 (0,13-35,6)2

6,81 (0,76-60,8)3

Gly/Gln

6/35 (0,17)

4/24 (0,17)

11/41 (0,27)

1/50 (0,02)

pIII-IV<0,05

10,2 (1,16-88,5)1

9,8 (1,03-93,2)2

17,9 (2,21-146,3)3

p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 с поправкой Йетса),

OR - отношение шансов, CI - 95% доверительный интервал.

Степень риска развития скрытого сифилиса и сифилиса с серорезистентностью у носителей гомозиготного генотипа полиморфизма TLR2 –753 Arg/Arg (rs5743708) оказалась крайне низкой. Вероятность реализации раннего скрытого сифилиса у гетерозигот Arg/Gln была равной 2,97 (95% CI:0,26-34,1), позднего скрытого – 2,97 (95% CI:0,26-34,1), сифилиса с серорезистентностью – 6,81 (95% CI:0,76-60,8).

Наиболее высокой оказалась вероятность развития сифилитического процесса у гомозигот по дикому аллелю Gln/Gln, при раннем скрытом сифилисе OR=10,2 (95% CI:1,16-88,5), при позднем скрытом – 9,8 (95% CI:1,03-93,2), при сифилисе с серорезистентостью – 17,9 (95% CI:1,21-146,3).

Ранее было показано, что полиморфизм TLR2 Arg753Gln связан с повышенным риском туберкулеза, а также высокой вероятностью развития инфекционного эндокардита, стафилококковой инфекции и проказы [9-11].

Работы по исследованию генного полиморфизма rs5743708 (Arg753Gln) при сифилисе единичны. Полученные нами результаты согласуются с результатами C.M. Marra et al. (2014), свидетельствующими о преобладании пациентов с генотипом TLR2_2258GA в группах с клинически манифестным или асимптомным нейросифилисом [12].

Значение TLR2 при сифилитической инфекции была подтверждено в экспериментальных исследованиях, свидетельствующих о том, что однонуклеотидные мутации TLR2 способны уменьшать активацию макрофагов при взаимодействии с антигеном бледной трепонемы TpN47 [12].

Ранее было установлено, что исследуемый участок Arg753Gln расположен в пределах TIR-домена рецептора TLR2, локализующегося в цитозоле, и его конфигурация влияет на развитие инфекций [7; 11; 12].

Анализ распределения аллелей и генотипов полиморфизма TL6 – 249 Ser/Pro (rs5743810) не выявил достоверных отличий в распространенности дикого Ser/249 и мутантного Pro/249 аллелей у пациентов со скрытым и серорезистентным сифилисом (табл. 3).

Однако вероятность развития заболевания увеличивалась у резидентов аллеля Ser/. Относительный риск развития сифилиса для обладателей гетерозиготного генотипа Pro/Ser был равным 1,34 (95% CI: 0,67-2,70), для резидентов гомозиготного Ser/Ser – 2,07 (95% CI: 0,78-5,49).

Таблица 3

Распределение частот аллелей и генотипов TLR6 у больных со скрытым сифилисом и сифилисом с серорезистентностью

Ген

Аллели

/генотип

Сифилис

Контрольная группа

χ2

OR (95% CI)

 

Ser

83/200 (0,42)

30/100 (0,3)

 

1,65 (0,99-2,76)

Pro

117/200 (0,58)

70/100 (0,7)

 

0,60 (0,36-1,00)

Ser/Ser

22/100 (0,22)

6/50 (0,12)

 

2,07 (0,78-5,49)

Pro/Ser

43/100 (0,43)

18/50 (0,36)

 

1,34 (0,67-2,70)

Pro/Pro

35/100 (0,35)

26/50 (0,52)

p<0,05

0,50 (0,25-0,99)

p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 Пирсона),

OR - отношение шансов, CI - 95% доверительный интервал.

При этом наблюдалось достоверное уменьшение распространенности гомозиготного генотипа Pro/Pro у пациентов со скрытым сифилисом и сифилисом с серорезистентностью (0,35 и 0,52, p<0,05).

У пациентов с развитием серорезистентности чаще, чем у здоровых респондентов, определялось носительство дикого аллеля Ser/249 (0,46 и 0,30, p<0,05), реже мутантного – Pro/249 (0,54 и 0,70, p<0,05). Менее распространенным оказался и гомозиготный по мутантному аллелю генотип Pro/Pro (0,27 и 0,52, p<0,05) (табл. 4).

При раннем скрытом сифилисе редко определялся гетерозиготный вариант Ser/Pro. Однако гетерозигот Ser/Pro оказалось существенно больше среди пациентов с поздним скрытым сифилисом и сифилисом с серорезистентностью, для этих пациентов степень риска развития заболевания составила 2,10 (95% CI: 0,78-5,65) и 2,06 (95% CI: 0,89-4,78) соответственно.

Таблица 4

Распределение частот аллелей и генотипов гена TLR6 у больных со скрытым сифилисом и сифилисом с серорезистентностью

Аллели

/генотип

Ранний скрытый сифилис (I)

n=35

Поздний скрытый сифилис (II)

n=24

Серорезис-тентный сифилис (III)

n=41

Контрольная

группа

(IV)

n=50

χ2

OR (95% CI)

Ser

24/70 (0,34)

21/48 (0,44)

38/82 (0,46)

30/100 (0,3)

pIII-IV<0,05

1,22 (0,63-2,30)1

1,82 (0,89-3,20)2

2,01 (1,10-3,71)3

Pro

46/70 (0,66)

27/48 (0,56)

44/82 (0,54)

70/100 (0,7)

pIII-IV<0,05

0,82 (0,43-1,58)1

0,55 (0,22-1,12)2

0,50 (0,27-9,13)3

Ser/Ser

11/35 (0,31)

3/24 (0,13)

8/41 (0,19)

6/50 (0,12)

 

3,36 (1,11-10,22)1

1,05 (0,24-4,60)2

1,78 (0,56-5,62)3

Ser/Pro

8/35 (0,23)

13/24 (0,54)

22/41 (0,54)

18/50 (0,36)

pI-II <0,05

pI-III<0,05

0,53 (0,20-1,40)1

2,10 (0,78-5,65)2

2,06 (0,89-4,78)3

Pro/Pro

16/35 (0,46)

8/24 (0,33)

11/41 (0,27)

26/50 (0,52)

pIII-IV<0,05

0,78 (0,33-1,85)1

0,46 (0,17-1,22)2

0,34 (0,14-0,82)3

p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 с поправкой Йетса),

OR - отношение шансов, CI - 95% доверительный интервал.

Гомозиготный генотип Ser/Ser чаще встречался при раннем скрытом сифилисе (OR = 3,36, CI: 1,11-10,22) и сифилисе с серорезистентностью (OR = 1,78, CI: 0,56-5,62).

Известно, что ген TLR6 расположен на длинном плече 13 хромосомы (4р13), кодирует рецептор, состоящий из 796 аминокислот, способный распознавать микробные паттерны грибов и грамположительных бактерий и инициировать активацию фактора транскрипции (NF-kB) посредством адаптерных белков MyD88 и TRAF6 [13]. В результате синтезируются IL1, IL2, IL6, TNFα, имеющие провоспалительный потенциал и стимулирующие иммунный ответ.

В ряде зарубежных публикаций показана связь между SNP TLR6 и развитием инфекционного процесса. Выявлено, что SNP T1932G (A644A) коррелирует с измененной секрецией IF? в ответ на стимуляцию мононуклеарных клеток периферической крови вирусом кори [13], тогда как как C745T является фактором риска развития инвазивного аспергиллеза [14].

Установлено, что SNP TL6 –249 Ser/Pro (rs5743810) инициирует высвобождение IF? после введения вакцины BCG [15]. У носителей Ser/Ser установлен низкий уровень IL6, что уменьшает интенсивность иммунного ответа.

Выводы

  1. Полиморфизмы генов врожденного иммунитета TLR2 Arg753Gln (rs5743708), TLR6 Ser249Pro (rs5743810) ассоциированы с развитием скрытых форм сифилиса и сифилиса с серорезистентностью у пациентов Юга России.
  2. Молекулярно-генетическими маркерами повышенного риска развития скрытых форм сифилиса и сифилиса с серорезистентностью являются генотипические варианты 753 Arg/Gln и 753 Gln/Gln, 249 Pro/Pro, а также наличие аллелей Gln/753, Pro/249. Протективными свойствами обладают гомозиготные генотипы TLR2-753 Arg/Arg, TLR6 –249 Pro/Pro и аллель Pro/249.
  3. Факторами риска развития серорезистентности при сифилисе является носительство аллелей Gln/753, Pro/249 и генотипов 753 Arg/Gln и 753 Gln/Gln, 249 Pro/Pro.