Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Колибактериоз  - общее название группы инфекций, вызываемых кишечной палочкой Escherichia coli и, реже, другими эшерихиями - E.paracoli, E. fergusonii, вызывающими большую группу разнообразных заболеваний человека и животных [1; 2]. В настоящее время колибактериоз остается одним из серьёзных заболеваний сельскохозяйственных животных [1]. В животноводстве заболевание приводит к значительной гибели молодняка и большим потерям привесов у взрослого поголовья [3].

Широкая распространённость вирулентных штаммов кишечной палочки и разнообразие серологических и токсигенных свойств бактерии осложняет создание универсальной вакцины против данного заболевания [1; 4; 5]. В последние годы в качестве живой вакцины успешно применяется слабовирулентный α-гемолитический штамм E. coli Б-5, иммунизация которым приводит к формированию устойчивого антитоксического иммунитета [6; 7]. Однако использование живых вакцин может быть опасно при иммунодефицитных состояниях и связано с интродукцией в окружающую среду потенциально опасного микроба [5].

Одним из перспективных подходов к профилактике колибактериоза является применение субъединичных вакцин [8; 9; 10]. Для повышения иммуногенности субъединичных вакцин используются различные адъюванты: ланолин, фосфат и гидроксид алюминия, хлорид и фосфат кальция, силикаты, нуклеотиды, полианионы и др. [11]. Перспективным направлением в вакцинологии является использование адъювантных свойств различных наночастиц [12; 13]. Так, для иммунизации против колибактериоза были использованы частицы селена, связанные с антигенами E. coli Б-5, что повышало выживаемость мышей на 50% в сравнении со стандартным формалинизированным анатоксином культуры E. coli Б-5 при летальном заражении [14].

Активность ряда ферментов крови является индикатором иммунологического статуса и биохимического гомеостаза организма животного. К ним относятся такие ферменты, как аспартатаминотрансфераза (АСТ) и креатинкиназа (КК), отражающие интенсивность аэробных процессов окисления, а также аланинаминотрансфераза (АЛТ) и лактатдегидрогеназа (ЛДГ), свидетельствующие о направленности метаболизма [15]. В здоровом организме повышение активности АЛТ свидетельствует об активизации пластических процессов. Повышение активности АСТ свидетельствует о преобладании энергозатратных процессов, в том числе при иммунном ответе организма на внедрение патогена и т.д. КК стимулирует процессы окислительного фосфорилирования в митохондриях [16]. Активность ЛДГ в крови повышается при энергозатратных процессах, требующих восполнения питательных веществ, а соотношение АСТ/ЛДГ отражает соотношение аэробного и анаэробного окисления углеводов [16]. Отношение АСТ/АЛТ, или коэффициент де Ритиса, отражает баланс энергетического и пластического обмена [16]. Для оценки сбалансированности метаболических процессов в организме животного предложен также индекс ферментемии (ИФ): ИФ = АСТ/АЛТ + АСТ/ЛДГ + КК/ЛДГ [15; 17; 18]. Показано, что чем ниже значение ИФ в крови животного, тем выше активность анаболических процессов [15].

Помимо иммуностимулирующего, у любой вакцины имеются побочные эффекты, в частности нарушения метаболического гомеостаза, которые следует учитывать при иммунизации животных [19; 20]. Ранее было показано, что биохимическое состояние макроорганизма сказывается на заражении и исходе бактериального заболевания [15; 16; 18]. Инфицирование цыплят-бройлеров штаммом Е. coli Б-5 приводит к увеличению в крови активности КК, значений коэффициента де Ритиса и ИФ, снижению активности АЛТ и ЛДГ [16]. При инфекционных заболеваниях, вызванных различными токсигенными микроорганизмами, наблюдается повышение ИФ и коэффициента де Ритиса, что обусловлено интенсификацией окислительного фосфорилирования [16]. Повышение активности АСТ в крови иммунизированных животных прямо корреллирует с метаболической активностью лейкоцитов, рост активности КК указывает на защиту клеток от цитолиза [16], т.е. изменение активности ферментов является не только маркером течения инфекционного процесса, но может играть защитно-компенсаторную роль [21].

Для коррекции метаболических эффектов, вызванных вакцинацией, может быть полезно применение модуляторов метаболизма [22]. Одним из возможных усилителей протективного эффекта является соматотропный гормон (СТГ), стимулирующий анаболические процессы [23]. В силу сказанного логично предположение, что коррекция биохимического состояния организма путём введения СТГ параллельно с вакцинацией животных против колибактериоза может приводить к росту протективного эффекта иммунизации и снятию её побочных эффектов.

Цель исследования состояла в оценке повышения протективности иммунизации животных против колибактериоза культурой E.coli Б-5 с восстановленным селеном, несущей клеточные и экстрацеллюлярные антигены, путем одновременного введения соматотропного гормона и выяснении сопутствующих биохимических последствий иммунизации.

Материал и методы исследования. В работе использовали штамм E. coli Б-5 из музея культур Саратовского научно-исследовательского ветеринарного института, применяющийся в качестве вакцинного [7].

Приготовление культуры с восстановленным селеном, несущей клеточные и экстрацеллюлярные антигены E. coli Б-5 (КВС). 10 мл селенитового бульона (НПО «Питательные среды», Россия) инокулировали суточной агаровой культурой E. coli Б-5 (1 млрд КОЕ/мл) и культивировали в течение 18 ч (37 °С). Для восстановления остаточного селенита в культуру вносили 400 мкл 30% тиосульфата натрия до конечной концентрации 1.2% и инкубировали в течение 2 ч (37°С).

Исследование проводили на беспородных кроликах-самцах весом 3,5±0,2 кг, формировали 4 группы животных по 6 голов. Животных одной группы иммунизировали КВС в дозе 0.1 мл/кг веса, подкожно, двукратно с интервалом в неделю (группа «КВС»); другим подкожно вводили СТГ в дозе 0,067 мг/кг (0,022 ЕМ/кг), 2 раза в день в течение 6 дней (группа «СТГ»); животных третьей группы иммунизировали КВС одновременно с инъекцией СТГ, как указано выше (группа «КВС+СТГ»). Животные четвертой группы получали 0,9% NaCl в объеме 0.1 мл/кг веса дважды в день в течение 6 дней («Контроль»). От животных до начала инъекций и через две недели после их окончания получали образцы сыворотки крови.

В сыворотке крови с помощью полуавтоматического биохимического анализатора Sinnowa BS-3000P с использованием соответствующих наборов реагентов ЗАО «Диакон-ДС» согласно указаниям производителя определяли концентрацию общего белка, глобулина, глюкозы, активность ферментов АЛТ, АСТ, КК и ЛДГ; вычисляли интегральные показатели биохимического статуса - коэффициент де Ритиса и индекс ферментемии (ИФ) [17].

Определение агглютинативной активности сыворотки крови против клеток суточной агаровой культуры E. coli Б-5 проводили в объемной модификации в разведении сыворотки крови 1:50 в физиологическом растворе, полноту агглютинации оценивали в крестах [24].

Определяли способность сыворотки крови поддерживать рост E. coli Б-5 in vitro. Образцы сыворотки крови инокулировали клетками E. coli Б-5 до плотности 10 млн КОЕ/мл, полученные культуры инкубировали 6 ч при 37 ºС. Концентрацию колониеобразующих единиц E. coli Б-5 в культурах определяли высевом на мясопептонный агар. Находили связь роста плотности культуры с биохимическими параметрами крови, используя методы корреляционного анализа – корреляцию Пирсона и множественной корреляции, достоверность различий определяли в тесте Стьюдента [25].

Через 3 недели после начала инъекций все экспериментальные животные были заражены внутривенно летальной дозой E. coli Б-5 (2*10⁹ КОЕ/кг веса). В течение 2 недель после заражения регистрировали гибель животных, по истечении 14 дней выживших животных забивали и производили патоморфологический анализ органов [26].

Результаты исследования и обсуждение. Иммунизация культурой E. coli Б-5 с восстановленным селеном усиливает агглютинирующую способность сыворотки крови в отношении клеток бактерии. Степень агглютинации клеток E. coli Б-5 составила для групп «КВС» и «КВС+СТГ» - «++++», для животных группы «СТГ» - «++», для «Контроля» – «+».

Как иммунизация, так и применение СТГ заметно сказываются на биохимических показателях, причем разным образом (табл. 1).

Таблица 1

Активность ферментов сыворотки крови и значения коэффициента де Ритиса и индекса ферментемии у подопытных животных на 14-й день эксперимента, нКат/л

Примечание: ¹ – значение отличается от контроля при p<0,05.

Иммунизация у животных группы «КВС» приводит к росту активности АСТ при снижении активности АЛТ, вызывая повышение коэффициента де Ритиса и индекса ферментемии (ИФ), что свидетельствует о биохимическом сопровождении иммунизации. Инъекции СТГ приводят к падению активности всех ферментов и некоторому, недостоверному, снижению ИФ, что свидетельствует о преобладании анаболических процессов. Введение СТГ при иммунизации приводит к росту активности АЛТ при падении АСТ, мало затрагивая активность остальных ферментов, что приводит к падению значений коэффициента де Ритиса и ИФ в сравнении с контролем. Таким образом, СТГ при иммунизации стимулирует изменение активности комплекса ферментов, стимулирующее анаболические процессы [16].

Данные по влиянию инъекций СТГ и КВС на концентрацию глюкозы, общего белка и глобулинов в сыворотке крови приведены в таблице 2. СТГ вызывал рост концентрации общего белка и глобулина, что свидетельствует о стимуляции анаболизма. Иммунизация КВС приводила к падению концентрации глобулина в сыворотке, но параллельное введение СТГ, снижая концентрацию общего белка, повышало концентрацию глобулина.

Таблица 2

Концентрации общего белка, глобулина и глюкозы в сыворотке крови экспериментальных животных на 14-й день эксперимента

Примечание: ¹ – значение отличается от контроля при p<0,05.

Плотность колониеобразующих единиц в культурах E. coli Б-5 на сыворотке крови in vitro на 6-й час инкубации составила для группы «КВС» 327±5, для «КВС + СТГ» 27±1, для группы «СТГ» составила 248±4 и для контроля – 177±3 миллионов КОЕ/мл. Неожиданным фактом является более сильный рост E. coli Б-5 в сыворотке крови животных, иммунизированных только культурой с восстановленным селеном, сыворотка животных, получавших СТГ, также хорошо поддерживала рост бактерии. Однако сыворотка крови животных, параллельно получавших КВС и СТГ, поддерживала рост хуже, чем сыворотка контрольных животных, т.е. вакцинация КВС совместно с инъекциями СТГ снижает пригодность сыворотки крови для роста E. coli Б-5.

Корреляционный анализ плотности колониеобразующих единиц E. coli Б-5 в культурах на сыворотке крови для всех животных, независимо от иммунизации или инъекций СТГ, выявил сильную связь роста с активностью АЛТ (табл. 1) и слабую - с концентрацией глюкозы в сыворотках (табл. 2). Корреляционный коэффициент Пирсона для пары КОЕ/АЛТ составил -0,97 (p<0.05), для пары КОЕ/глюкоза +0,54 (p>0.05), коэффицент множественной корреляции для плотности КОЕ с АЛТ и концентрацией глюкозы составил 1,00 (p<0.01). Таким образом, рост бактерии в сыворотке контролируется как глюкозой, так и активностью АЛТ. Ранее для Staphylococcus aureus было показано отрицательное влияние активности АЛТ на рост бактерии в сыворотке крови, что связано с отрицательным влиянием продукта активности фермента – пирувата – на скорость размножения клеток [27]. S. aureus обладает смешанным аэробно-анаэробным метаболизмом, подобным метаболизмом обладает и E. coli Б-5, что может объяснить отрицательное влияние активности АЛТ на рост последней, и рост E. coli Б-5 в сыворотке экспериментальных животных контролируется не только концентрацией специфических иммуноглобулинов, но и ферментемией сыворотки.

СТГ активизирует анаболизм, что сказалось на приросте массы тела животных группы «СТГ» на 0,08 ± 0,01 кг за 14 дней эксперимента. Вес кроликов, иммунизированных КВС, уменьшился, снижение веса составило 0,25 ± 0,03 кг. У животных остальных групп также наблюдались отрицательные приросты массы тела, для «КВС + СТГ» составившие 0,10 ±0,02 и для «Контроля» – 0,05 ±0,01 кг. Снижение веса в группе «КВС + СТГ» было меньше, чем в группе «КВС», что свидетельствует об анаболическом действии СТГ при иммунизации.

Выживаемость при заражении летальной дозой клеток E. coli Б-5 составила 50% для животных, иммунизированных КВС; 0% для животных, получавших СТГ, и 100% при одновременном введении КВС и СТГ, что свидетельствует об иммуностимулирующем эффекте соматотропного гормона.

По истечении 20 дней после заражения произвели патоморфологическое обследование выживших животных. У кроликов группы «КВС» наблюдались круппозная пневмония, регионарный лимфонодулит и признаки гипертермии, у животных группы «Sе бульон+СТГ» обнаружена только гиперемия легких. Таким образом, СТГ может ослаблять остаточные явления и ускорять клиническое выздоровление при колибактериозе.

Заключение

Протективность иммунизации кроликов культурой E. coli Б-5 с восстановленным селеном при летальном заражении составляет 50%. Использование соматотропного гормона повышает протективность иммунизации до 100% и уменьшает остаточные явления у выживших животных, нормализирует метаболизм и вес при иммунизации, корректируя ряд биохимических показателей. Таким образом, применение СТГ и восстановленного селена в качестве адъюванта может быть перспективным при борьбе с колибактериозом.