Актуальность
Лечение длительно незаживающих ран покровных тканей является одной из актуальных проблем медицины. Широко распространенным методом лечения дефектов мягких тканей является свободная кожная пластика. Однако, по данным литературы, известно, что в условиях циркуляторной гипоксии площадь полного или частичного лизиса трансплантатов при свободной кожной пластике составляет от 19,5 до 37,5% [1]. В настоящее время предложено большое количество методов подготовки аутодермотрансплантата к условиям скомпрометированной микроциркуляции, например введение в донорскую область озонированного физиологического раствора [2], кислорода [3], оксигенированного перфторана [4]. Однако предложенные способы не всегда безопасны и могут сопровождаться нагноением, возникновением инфильтрата и т.д.
С нашей точки зрения, в условиях скомпрометированной микроциркуляции целесообразна тренировка будущего трансплантата кожи к кислородному голоданию. Это возможно при создании условий, при которых на фоне снижения трофики тканей включается каскад компенсаторных механизмов, направленных на защиту тканей от гипоксии.
В публикациях мы не обнаружили данных о зависимости между тренировкой трансплантата кожи и индексом пролиферации (Ki-67), а также выделением фактора роста эндотелия сосуда (VEGF). Представленное экспериментальное исследование посвящено поиску ответа на этот вопрос.
Материалы и методы
Объектом исследования в эксперименте явилась кожа донорской области, находящаяся в условиях локальной циркуляторной компенсированной гипоксии. Предмет исследования составила активность процессов репаративной регенерации и наличие сигнального белка VEGF в дерме при тренировке трансплантата к условиям гипоксии. Задачей экспериментального исследования явилось: изучение влияния локальной циркуляторной гипоксии на активность процессов репаративной регенерации и ангиогенеза. В эксперименте моделировался этап кожной пластики, связанный с тренировкой участка кожи к условиям гипоксии путем нанесения двух параллельных разрезов кожи до фасции.
Научная гипотеза заключалась в том, что в условиях контролируемой гипоксии, созданной путем нанесения двух параллельных разрезов кожи, активизируются процессы репаративной регенерации в области между разрезами.
При проведении экспериментальных исследований использовали
9 экспериментальных животных (крыс) массой 250-300 г. Экспериментальные исследования включали в себя выполнение следующих этапов:
1. Моделирование условий гипоксического прекондиционирования кожи донорской области нанесением двух параллельных разрезов кожи и создания области локальной циркуляторной гипоксии.
2. Гистологическое, морфологическое и иммуногистохимическое исследование образцов кожи, находящихся между разрезами, и образцов симметричных участков кожи вне гипоксии через 2 суток после оперативного вмешательства.
3. Статистическая обработка результатов исследования.
Всем животным на коже правого бедра после обработки операционного поля раствором антисептика наносили 2 параллельных разреза кожи до мышц, длиной 2 см, на расстоянии 1 см друг от друга (рис. 1).
Рис. 1. Формирование двух параллельных разрезов кожи правого бедра до мышц
При этом дальнейшую мобилизацию кожного лоскута проводили под контролем микроциркуляции с помощью лазерной доплеровской флоуметрии (аппарат ЛАКК-02) (рис. 2).
Рис. 2. ЛАКК-02 (лазерный анализатор капиллярного кровотока)
При снижении показателя микроциркуляции (ПМ) на 40-50% от исходного мобилизацию кожного лоскута прекращали (рис. 3).
Рис. 3. Мобилизация кожного лоскута под контролем лазерной доплеровской флоуметрии
После гемостаза накладывали внутрикожный шов атравматичной нитью Пролен 4.0 (рис. 4).
Рис. 4. Вид послеоперационной раны после ушивания внутрикожным швом
Через 2 суток проводили забор образцов кожи, находящейся в условиях гипоксии между разрезами и на симметричном участке вне гипоксии.
Операционный материал фиксировали в растворе нейтрального 10%-ного формалина. Стандартную гистологическую проводку осуществляли на аппарате Excelsior ES (Thermo Scientific). После проводки изготовляли парафиновые блоки с использованием заливочной станции HistoStar (Thermo Scientific). Срезы толщиной 4-6 мкм получали на микротоме Microm HM 325 (Thermo Scientific), окрашивали гематоксилином и эозином.
Иммуногистохимическое окрашивание проводили в автоматизированном модуле – BOND-MAX (протокол F) c использованием системы детекции Bond polymer refine detecnion (Leyca Biosystems, UK) с предварительным депарафинированием срезов и демаскировкой антигенов. Были использованы моноклональные антитела к Ki-67, clon SP6 (Lab Vision Corporation, USA), антитела к VEGF, polyclonal (Diagnostic BioSystems, USA). Для оценки пролиферативной активности (ПА) подсчитывали количество Кi-67-положительных клеток в 10 полях зрения при х400. Индекс Кi-67 определяли по формуле: ИП = (n/N)x100%, где n – количество меченых ядер, N – общее число ядер в поле зрения микроскопа.
Для статистической обработки полученных данных использовали компьютерную программу Statistica 6.0. Для оценки статистической значимости различий при сравнении групп по количественному признаку в связанных группах использовали непараметрический критерий Вилкоксона. Выборочные параметры, приводимые далее, имеют следующие обозначения: Ме – медиана, Q1 – верхний квартиль, Q3 – нижний квартиль, n – объем анализируемой подгруппы, р – величина статистической значимости различий. Критическое значение уровня значимости принимали равным 5% (р≤0,05).
Результаты
Представлены результаты изучения влияния локальной циркуляторной гипоксии, возникающей при выполнении первого этапа кожной пластики, а именно нанесении двух параллельных разрезов кожи до мышц на пролиферативную активность лоскута.
При иммуногистохимическом анализе образцов ткани выявлены статистически значимые различия между активностью процессов регенерационной гипертрофии в основной и контрольной группах. В основной группе отмечалось появление клеток, экспрессирующих рецепторы к васкулярному эндотелиальному фактору роста (VEGF) (рис. 5).
Рис. 5. Поперечный срез дермы, основная группа. Клетки, экспрессирующие рецепторы к васкулярному эндотелиальному фактору роста (показаны стрелкой). Иммуногистохимическое окрашивание с применением антитела к VEGF. Увеличение в 200 раз
По данным морфометрического анализа иммуногистохимических препаратов кожи, индекс пролиферации в контрольной группе составил 25% [19; 31], в основной – 37% [30; 44], (р=0,018) (рис. 6).
А) 
Б)
Рис. 6. Поперечный срез дермы, контрольная группа (А) и основная группа (Б). Пролиферация клеток соединительной ткани, Ki-67 позитивные клетки. Иммуногистохимическое окрашивание с применением антитела к Ki-67. Увеличение в 400 раз
Обсуждение
Кожа играет важнейшую роль в организме человека – целостность кожного покрова напрямую связана с поддержанием гомеостаза организма. Сосудистая система кожи состоит из артериальных (поверхностное и глубокое) и венозных (два поверхностных и глубокое) сплетений [5]. Между эпидермисом и сосочковым слоем дермы находятся узкие петли (ячейки) поверхностной артериальной сети [6]. При повреждении кожных покровов происходят значительные структурные изменения, связанные с потерей белка и жидкости, организм становится восприимчив к инфекциям и т.д. Невозможность самостоятельного закрытия ран требует от врача активных действий. Свободная кожная пластика остается на сегодняшний день методом выбора в лечении больных с длительно незаживающими ранами [7]. Одним из самых частых осложнений свободной кожной пластики является некроз трансплантата, причем «критическим сроком» являются 3-5 сутки после оперативного вмешательства.
В настоящее время предложено большое количество способов подготовки трансплантата к кожной пластике, связанных с введением биологически активных веществ в донорскую зону, но, к сожалению, каждый из них имеет недостатки. Авторским коллективом предложен способ подготовки трансплантата к свободной кожной пластике путем стимуляции процессов репаративной регенерации без введения веществ извне (заявка на патент на изобретение РФ № 2016104520). Способ основан на предложенном в 1984 году
Я. Золтаном [8] методе тренировки лоскута кожи для аутодермопластики местными тканями и связан со стимуляцией роста сосудов на фоне снижения кровоснабжения закроенного лоскута кожи, то есть феноменом гипоксического прекондиционирования. При недостаточной циркуляции крови в тканях (в условиях циркуляторной гипоксии) сигнальный белок VEGF отвечает за восстановление подачи кислорода к тканям и стимулирует ангиогенез (рост сосудов из уже существующих) и васкулогенез (образование новой сосудистой сети). В условиях гипоксии повышается уровень Ki-67 ядерного белка, являющегося маркером, необходимым для определения прироста клеточной популяции (индекс пролиферации). Однако описания использования метода гипоксического прекондиционирования для свободной кожной пластики в литературных источниках мы не нашли. Основываясь на исследованиях М.В. Морозова (2008) [9], в которых доказано, что глубина залегания капилляров сосочкового слоя и сосудов субпапиллярного сплетения оставляет 66±0,7 и 85±0,45 мкм соответственно, и учитывая тот факт, что толщина свободного трансплантата составляет 300-400 мкм, считаем возможным применить данный способ при выполнении свободной кожной пластики. Гипотеза, заключавшаяся в том, что в условиях контролируемой гипоксии путем нанесения двух параллельных разрезов кожи перед выполнением свободной кожной пластики активизируются процессы репаративной регенерации и ангиогенеза в области между разрезами, подтвердилась, что дает основания для возможности дальнейшего применения метода в клинике.
Выводы
По данным иммуногистохимического анализа, в условиях локальной циркуляторной компенсированной гипоксии через 2 суток после нанесения двух параллельных разрезов кожи до мышц и при снижении показателя микроциркуляции в лоскуте на 50% от исходного появляются клетки, экспрессирующие рецепторы к васкулярному эндотелиальному фактору роста (VEGF), а также происходит увеличение индекса пролиферации (Ki-67) с 25 до 37%, что свидетельствует о возможности тренировки трансплантата при кожной пластике.