Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,737

INFLUENCE OF COMPLEX APOLIPOPROTEIN A-I IN WITH ACTINOMYCIN D OF DNA BIOSYNTHESIS IN NORMAL AND TUMOR CELLS

Trifonova N.V. 1 Knyazev R.A. 1 Polyakov L.M. 1
1 Federal State Budgetary Sientific Institution Research Institute of Biochemistry
Химиотерапия является одним из основных способов коррекции роста злокачественных новообразований. Однако этот способ терапии связан с риском интоксикации организма противоопухолевыми препаратами и их метаболитами. Поэтому одним из актуальных вопросов современной фармакологии остается разработка препаратов направленного противоопухолевого действия либо создание лекарственных форм избирательного действия уже известных цитостатиков с целью усиления эффективности химиотерапии и снижения общего токсического эффекта на организм. В данной работе в качестве переносчика противоопухолевого препарата актиномицина Д использовали аполипопротеин А-I. Показано, что актиномицин Д в комплексе с аполипопротеином А-I в концентрации ниже пороговой снижал скорость биосинтеза ДНК в клетках асцитной карциномы Эрлиха по сравнению с препаратом без переносчика. Полученные результаты позволяют сделать вывод о повышении цитостатического эффекта актиномицина Д при использовании его в составе комплекса с аполипопротеином А-I.
Chemotherapy is one of the main ways of correction growth of malignant neoplasms. However, this method of therapy associated with the risks of intoxication anticancer drugs and their metabolites. Therefore, one of the pressing issues of modern pharmacology is the development of drugs aimed antitumor action or creating dosage forms selective cytostatics already known to enhance the effectiveness of chemotherapy and reduce general toxic effect on the patients. In this paper as a carrier of anticancer drug actinomycin D was used apolipoprotein A-I. It is shown that the actinomycin D in a complex with apolipoprotein A-I in a concentration below the threshold reducedspeed DNA biosynthesisin cells of Ehrlich ascites carcinoma in comparison with the preparation without a carrier. These results suggest a cytostatic effect increasing actinomycin D, when used in the complex with apolipoprotein A-I.
transport form of anticancer drugs
apolipoprotein A-I
hepatocytes
actinomycin d
Ehrlich ascites carcinoma
chemotherapy

Терапевтический эффект препарата во многом зависит от способности лекарственной формы достигать патологических участков. В последние годы наблюдается рост научных исследований в области таргетной терапии опухолей, разработаны наночастицы, способные выступать в качестве переносчиков лекарственных средств [6]. Ранее нами была показана способность аполипопротеина А-I (апоА-I) образовывать комплексы с такими противоопухолевыми препаратами, как актиномицин Д и винбластин, изучено влияние этих комплексов на биосинтез ДНК в клетках асцитной карциномы Эрлиха [1,2]. В своей работе мы использовали актиномицин Д – препаратиз группы противоопухолевых антибиотиков, продуцируемых актиномицинами Streptomyces parvullus. Его противоопухолевое действие обусловлено интеркаляцией между парами азотистых оснований гуанин-цитозин ДНК и препятствием движению РНК-полимеразы, нарушая, таким образом, транскрипцию антиапоптозных генов [10]. Актиномицин Д представляет собой один из химиотерапевтических препаратов, которые используют в лечении различных видов рака, и является составной частью комбинированной терапии опухолей у детей [12].

Целью настоящей работы явилось изучение влияния апоА-I в комплексе с актиномицином Д на скорость биосинтеза ДНК в культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха и гепатоцитов.

Материалы и методы

Выделение аполипопротеина А-I

Белок получали путем делипидирования липопротеиновых фракций высокой плотности (ЛПВП), охлажденной смесью этанол-ацетон (1:1). Осадок белков многократно отмывали охлажденным эфиром и высушивали в токе азота. Смесь белков (20–30 мг), солюбилизировали в растворе (2 мл), содержащем 3 % DS-Na (m/V), 1 мМ меркаптоэтанол и наносили на колонку (1,6 х 100 см, V0 = 55 мл) с Сефарозой 6В-CL («Pharmacia», Швеция). Элюировали 0,01 М трис-НСl буфером (рН 8,6), содержащим мочевину (6 М), азид натрия (0,01%) и фенилметансульфонилфторид (1 мМ).

Скорость потока элюента при хроматографии составляла 10 мл/ч, продолжительность сбора одной фракции – 20 мин, скорость самописца – 0,015 см/мин. Профиль элюции регистрировали на УФ-детекторе при длине волны 280 нм и уровне чувствительности 1,28. Проверку чистоты апоА-I осуществляли методом диск-электрофореза в ПААГ с DS-Na. Для разделения смеси белков использовали 3 % концентрирующий и 12,5 % разделяющий гель (V/V), содержащие 0,1 % DS-Na. Объем пробы составлял 10–20 мкл. Электрофорез проводили в трис-глициновом буфере (рН 8,3), содержащем 0,1 % DS-Na, при комнатной температуре в течение 3 ч при силе тока 10–20 мА на см2 [5]. Белковые полосы визуализировали 0,1 % Кумасси G-250 в смеси метанола и 10 % уксусной кислоты (1:1, V/V). В качестве маркеров использовали набор белков-стандартов («Page Ruler Prestained Protein Ladder» 10-170 кДа «Thermo Scientific», США).

Обессоливание апоА-I проводили методом гель-фильтрации. Раствор белка в мочевине (1,5–2 мл) наносили на колонку (0,8 х 20 см, V0 = 6 мл) с Сефадексом G-25 («Pharmacia», Швеция), и элюировали 0,05 М калий-фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl. Скорость потока – 1 мл/мин, скорость самописца – 0,15 см/мин.

Профиль элюции регистрировали на УФ-детекторе при длине волны 280 нм. Концентрация обессоленного белка составляла 0,2 мг/мл [4].

Оценка скорости биосинтеза ДНК в культуре клеток

Определение скорости биосинтеза ДНК оценивали по включению 3Н-тимидина. Для этого за 2 ч до окончания эксперимента в клеточную культуру добавляли 2мкКи/мл 3Н-тимидина («Amersham», Англия). После окончания культивирования клетки лизировали 0,2н раствором NaOH. Для измерения радиоактивности содержимое лунки (100 мкл) переносили на целлюлозные фильтры («Whatman 3 MM», Англия), предварительно обработанные 10 % трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Далее последовательно отмывали от несвязавшейся метки холодным раствором 10 % трихлоруксусной кислоты, затем в горячем 5 % ТХУ и смесью этанол-эфир (1:1). Радиоактивность образцов измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Дельта-300» (TM Analytic, Нидерланды) и выражали в имп/мин на 1 мг белка [8]. В работе использовали 1 мМ исходный маточный раствор актиномицина Д («Applichem», Германия).

Выделение клеток асцитной карциномы Эрлиха

Для эксперимента использовали мышей-самцов линии Black, массой 20–25 г. Клетки асцитной карциномы получали из перитонеального экссудатана 10 день после перевивания. Асцитную жидкость вносили в центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 10 мин при 150g для осаждения клеточных элементов. Осадок клеток трижды промывали холодным раствором Рингера – Кребса.

Изолирование и фракционирование клеток печени

Процедура получения гепатоцитов включала четыре основных этапа: (1) перфузия печени in situ раствором Хэнкса без Са++; (2) рециркуляционная перфузия печени in vitro раствором коллагеназы; (3) механическая дезагрегация ткани; (4) дифференциальное центрифугирование при 50g для получения осадка очищенных гепатоцитов [11]. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Жизнеспособность клеток оценивали по исключению трипанового синего [3].

Свежевыделенные клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 («Биолот», Россия), рН 7,4, содержащей 20 мM HEPES («ICN Biomedicals, Inc», США), 2 мM L-глутамина («Вектор», Россия), 100 ЕД/мл пенициллина, 50 мкг/мл гентамицина, 5,6 мM глюкозы. Планшеты предварительно покрывали раствором коллагена (0,1 мг/мл) в 0,1 % уксусной кислоте. После сорбции коллагена планшеты отмывали 0,9 % раствором NaCl и подсушивали. Инкубацию клеток (плотность 800 клеток/мм2) проводили в СО2-инкубаторе («Cole-Parmer», США) при температуре 37 °С, влажности 85 % в атмосфере, содержащей СО2 (5 %) и воздуха (95 %) [7]. Среду заменяли через 2 ч после посева клеток и образования монослоя.

Определение связывающей способности аполипопротеина А-I с противоопухолевым препаратом методом тушения триптофановой флуоресценции

Комплекс апоА-I с актиномицином Д получали, выдерживая их смесь в 0,05 М калий-фосфатном буфере, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, в течение 15 мин при комнатной температуре. Образование комплексов апоА-I с актиномицином Д подтверждали методом тушения триптофоновой флуоресценции. Для этого проводили титрование в термостатируемой кювете при температуре 20 ºС с добавлением аликвотцитостатика (по 1мкл) к 2 мл апоА-I в ФСБ (рН 7,4). Снижение флуоресценции составило 73 %. Данное снижение можно расценивать как результат образования комплекса аполипопротеин А-I–актиномицин Д [1]. Комплекс апоА-I–актиномицин Д добавляли к культуре клеток и инкубировали в течение 5 ч. Актиномицин Д применяли в двух концентрациях: 0,1 и 1 мкг/мл [10]. В качестве контроля выступали клетки, которым в среду инкубации добавляли физиологический раствор.

Статистическую обработку данных проводили при помощи программы StatPlus 2009 Professional5.8.4. (США). Статистическую значимость полученных результатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента при уровне значимости p<0,05.

Результаты исследования

На культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха показано, что сам апоА-I не изменял скорость биосинтеза ДНК в клетках (рис. 1). Однако присутствие в среде инкубации одного актиномицина Д, а также в составе комплекса апоА-I-актиномицин Д (концентрация актиномицина Д1мкг/мл среды) резко снижает скорость биосинтеза ДНК в клетках (рис.1). Следует отметить, что различия в этих двух группах между собой были незначительны.

Рис.1. Скорость биосинтеза ДНК в клетках асцитной карциномы Эрлиха. Концентрация актиномицина Д 1 мкг/мл

* – достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,001).

Мы уменьшили концентрацию цитостатика в 10 раз, т.о. она составила 0,1 мкг/мл среды. Оказалось, что в этой концентрации один актиномицин Д (0,1 мкг/мл) не оказывал цитотоксического эффекта – скорость включения 3Н-тимидина в ДНК практически не изменялась (рис. 2). Не влиял на включение метки в ДНК и апоА-I без цитостатика. Однако актиномицин Д в составе комплекса сапоА-I снижал биосинтез ДНК в клетках на 60 % по сравнению с контрольными величинами.

Рис. 2. Скорость биосинтеза ДНК в клетках асцитной карциномы Эрлиха. Концентрация актиномицина Д 0,1 мкг/мл

* – достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,04).

Следует задать вопрос: а как влияет в этой концентрации цитостатик (0,1 мкг/мл) на здоровые клетки? На культуре гепатоцитов здоровых крыс мы показали, что ни один из этих компонентов, в том числе и актиномицин Д в концентрации 0,1 мкг/мл, не оказывал статистически значимого влияния на скорость включения меченого тимидина в ДНК (рис. 3).

Рис. 3. Скорость биосинтеза ДНК в гепатоцитах.

Концентрация актиномицина Д 0,1 мкг/мл

Выводы

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что комплекс апоА-I с актиномицином Д обладает выраженным цитостатическим действием даже в минимальных концентрациях по сравнению с отдельно взятым противоопухолевым препаратом. Это можно объяснить наличием на мембране опухолевых клеток большого количества специфических рецепторов к апоА-I [9], что, по-видимому, позволяет препарату эффективнее попадать внутрь клетки и проявлять противоопухолевую активность.