Рак пищевода является одним из самых агрессивных среди злокачественных новообразований и занимает лидирующее шестое место в структуре смертности в Мире [16]. По данным Международного агентства по изучению рака (International Agency for Research on Cancer, IARC) на 2008 г., заболеваемость составила 49,2 случая на 100 тыс. населения в год, смертность – 34,3 на 100 тыс. По расчётам Росстата Минздрава РФ заболеваемость среди мужчин и женщин составила 7.6 и 2.4 случая на 100 тыс. населения, соответственно. Примерно, 70 % патологии приходится на Китай, с преобладанием плоскоклеточного рака пищевода (ПРП) в 90 %, с 10 % пятилетней выживаемостью таких пациентов. Достаточно эффективного лечения до сих пор не найдено, результаты химиолучевого лечения остаются неудовлетворительными, и с точки зрения генетики патогенез заболевания остается загадкой.
Рак пищевода по своим генетическим характеристикам имеет неоднородную структуру. Благодаря активному прогрессу в молекулярной онкологии и фармакологии, появилось понятие таргетного лечения, и за последнее десятилетие было создано около двух десятков специфических молекулярных ингибиторов [1]. Международные публикации по поводу исследования мутационного статуса генов H-RAS и ТР53 при раке пищевода начинают появляться с 1994 года [11]. В настоящее время одной из наиболее многообещающих мишеней для молекулярно-направленной терапии является рецептор эпидермального фактора роста (EGFR). Частота встречаемости данных мутаций ранее не оценивалась с необходимой достоверностью, в связи с небольшими размерами выборок больных РП (около 80 пациентов) [12]. Известно также, что мутации генов KRAS, NRAS, BRAF и каталитической субъединицы фосфатидилинозитол-3-киназы (PIK3CA), а также дисрегуляция экспрессии гена PTEN являются показателями анти-EGFR терапии при колоректальном раке и других злокачественных новообразованиях [4].
Группой ученых из Японии во главе с Shigaki H. и его коллегами было проведено исследование мутаций в генах KRAS и BRAF у 203 пациентов с ПРП с помощью технологии пиросеквенирования. Были оценены следующие соматические мутации: c.35G>T (кодон 12 GGT>GTT), c.35G>A (кодон 12 GGT>GAT), c.34G>T (кодон 12 GGT>TGT), c.38G>A (кодон 13 GGC>GAC), которые ранее обнаруживались в 100 % случаев (9 из 9) клеточных линий РП с помощью технологии Scorpion-ARMS. Однако мутации в гене KRAS были выявлены лишь в 1 случае ПРП из 203, что составляет 0.5 % от общего числа пациентов, а мутации гена BRAF совсем отсутствовали – 0 из 203. Результаты представленной работы дали возможность предположить, что мутации генов KRAS и BRAF играют очень ограниченную роль в развитии ПРП, и этот диагностический тест не является необходимым в качестве скрининга на определение чувствительности к анти-EGFR терапии [12].
Bettstetter M. и его коллеги исследовали мутационный статус у 117 первично-операбельных больных аденокарциномой пищевода, проводя корреляцию между экспрессией EGFR и амплификацией генов KRAS, NRAS, BRAF и PTEN, объединяя результаты. Мутации гена KRAS встречались у 4 (3 %) из 117 больных (3× G12D и 1х G12V мутации). В одном образце опухоли была выявлена мутация в гене PIK3CA (E545K), а мутации в генах NRAS и BRAF не встречались. У 16 из 117 пациентов (14 %) не было обнаружено мутаций в гене PTEN. При иммуногистохимическом анализе было выявлено снижение экспрессии гена PTEN, которое оценивалось преимущественно при распространённых стадиях болезни (P = 0.004). Не было показано корреляции между мутационным EGFR статусом и экспрессионным статусом гена PTEN. Функциональная потеря гена PTEN была связана с более короткой общей выживаемостью и выживаемостью без прогрессирования (P < 0.001 каждый), а также являлась независимым прогностическим фактором в мультифакторном анализе (P = 0.015). Статус гена EGFR не был ассоциирован с прогностической значимостью, тогда как снижение экспрессии в гене PTEN имело весомое значение при аденокарциноме пищевода (АП) и было связано с агрессивным фенотипом, обосновывая оценку статуса PTEN как биомаркёра. В контраст этому, мутационный статус каскада RAS/RAF/PIK3CA, по результатам этой работы, имел незначительное клиническое приложение [4].
Интересная работа была проведена Q.-W. Liu, где в отобранной выборке 50 пациентов с ПРП были изучены образцы опухоли после хирургической резекции пищевода. Мутации в 18–21 экзонах гена EGFR определялись с помощью технологии мутационно-специфической ПЦР с использованием праймеров Scorpions (SARMS). Мутации в 12,13 кодонах гена KRAS были обнаружены путем прямого секвенирования. Корреляция между клинико-патологическими особенностями и мутационным статусом генов EGFR и KRAS была проанализирована с использованием Пакета программ обработки статистических данных. В этом исследовании, миссенс-мутации G719X и L858R и делеции со сдвигом рамки считывания были выявлены в 14 % случаев (у 7 из 50 пациентов). Мутации в 12-ом кодоне гена KRAS диагностированы в 12 % случаев (6/50). В одном образце были обнаружены мутации генов EGFR и KRAS одновременно. Наличие EGFR и KRAS мутаций не было связано с полом, возрастом, курением в анамнезе, дифференцировкой клеток, или стадией заболевания. Частота встречаемости EGFR и KRAS мутаций у пациентов с ПРП была выше, чем было представлено в ранее выполненных исследованиях, что, возможно, связано с популяционными различиями. Показано также, что при ПРП мутации в генах EGFR и KRAS могут быть ко-сегрегированы [8].
Мутационный статус также оценивался не только при ПРП, но и при базалоидном подтипе. Базалоидная плоскоклеточная карцинома (БПК) пищевода является редким заболеванием, с особенными характеристиками, и является вариантом плоскоклеточного рака пищевода. В этом исследовании учёные изучили генетические и эпигенетические перестройки, такие как соматические мутации в генах KRAS, BRAF и PIK3CA, экспрессию гена ТР53 и метилирование суррогатного маркёра LINE-1 (длинного диспергированного ядерного элемента). Из 502 образцов 22 (4.4 %) являлись базалоидным вариантом ПРП, 440 (87 %) другими подтипами плоскоклеточного рака пищевода, что было подтверждено гистологически. Не было никакой прогностической разницы между БПРП и ПРП (p = 0.41). KRAS или BRAF мутации не встречались при базалоидном типе ПРП, в то время как 23 % образцов ПРП содержали мутацию в гене PIK3CA, отсутствующую во всех образцах БПРП (p = 0.002). Не было различий экспрессионного профиля гена ТР53 при БПРП и ПРП (p = 0.57). Тогда как низкий уровень экспрессии LINE-1 был характерен для БПРП (p < 0.0001). Определение мутационного и экспрессионного профилей могут менять терапевтическую стратегию при ПРП и БПРП [3].
Что касается АП, в 2016 году было проведено несколько исследований, касающихся диагностики соматических мутаций генов, вовлеченных в канцерогенез рака пищевода. Шведская команда учёных под руководством Hedner C. опубликовала результаты исследования, целью которого было проанализировать прогностическую значимость рецептора эпидермального фактора роста 1 (HER1/EGFR) и 3 (HER3), а также встречаемость EGFR и KRAS мутаций при аденокарциноме желудка и пищевода. Иммуногистохимически была определена экспрессия EGFR и HER3 во всех первичных опухолях и пораженных метастатических узлах у 174 пациентов с аденокарциномой желудка, кардии и пищевода. Мутационный статус генов EGFR и KRAS определялся с помощью технологии пиросеквенирования. По результатам этой работы был сделан вывод, что экспрессия гена EGFR является независимым прогностическим фактором и характеризуется более коротким периодом общей выживаемости. Мутации в гене KRAS были обнаружены только у 4 % пациентов и не имели прогностической значимости. Все опухоли содержали ген EGFR дикого типа. Исследователи обратили внимание, что полученные данные интересны в отношении продолжения попыток по поиску потенциальной клинической значимости различных HER-мутаций при раке желудка и АП [5].
Miller C.T. и его команда выполнили исследование по определению молекулярных характеристик пациентов с аденокарциномой, возникающей на фоне пищевода Барретта. Исследование проводилось с помощью методов полимеразно-цепной реакции (ПЦР) и Саузерн-блоттинга. Одна или более амплификаций встречались у 50 пациентов из 87, что составило 57 %. Амплификация гена ERBB2 встретилась в 19 из 87 (21.8 %), CCNE1 у 11 из 87 (12.6 %), GATA4 у 9 из 87 (10.3 %), KRAS у 9 из 87 (10.3 %), EGFR у 7 из 87 (8.0 %), CCND1 у 6 из 87 (6.8 %), HNF3-alpha у 5 из 87 (5.7 %), PIK3CA у 5 из 87 (5.7 %), C-MYC у 4 из 87 (4.6 %), DYRK2 у 2 из 87 (2.3 %), и AIB1, AKT1 и IGF1R у 0 из 87 (0 %) отобранных образцов. Амплификация CCND1 была связана с меньшей выживаемостью (P < 0.05). В дополнение, положительная амплификация ERBB2 коррелировала с наличием амплификации (P < 0.05) GATA4. Повышенное количество копий ERBB2 (1 из 22), GATA4 (1 из 22), KRAS (2 из 22), C-MYC (1 of 22), CCNE1 (2 из 22), и CCND1 (2 из 22) генов было также изучено, но встретилось лишь у одного пациента с пищеводом Барретта с выраженной дисплазией [9].
В последние годы увеличилось количество работ, посвященных клинико-генетическим корреляциям при злокачественных новообразованиях [5]. Согласно публикациям, мутации в гене PIK3CA обнаруживаются при многих опухолях, но коррелирует с различным прогнозом в зависимости от локализации. Частота встречаемости мутации гена при ПРП ранее изучалась, но должного прогностического анализа не было. Присутствие мутации гена PIK3CA связывают с плохим прогнозом у пациентов с колоректальным раком и раком лёгкого, тогда как mtPIK3CA-статус определяет благоприятный прогноз у пациентов, страдающих раком молочной железы [13].
В хирургическом отделении университета Нагойя, с 1996 года по 2003 г. было исследовано 88 образцов РП, где с помощью real-time-ПЦР осуществлялся поиск мутаций в 9 и 20 экзонах гена РIК3CA. В 2.2 % случаев выявлены мутации в 9 экзоне - E545K (G1633A) и E545Q (G1633C). Тогда как у пациентов с установленным диагнозом рак пищевода, мутаций в 20 экзоне обнаружено не было [10].
Shigaki H. и его команда изучили 219 образцов ПРП и 8 клеточных линий с помощью методики пиросеквенирования. Мутация PIK3CА в 9 и/или 20 экзоне определялась в 46 случаях образцах ПРП, что составило 21 %. В клеточных линиях мутаций найдено не было. Наличие мутации PIK3CA было в значительной степени ассоциировано с полом, возрастом, курением, употреблением алкоголя и гистологической дифференцировкой. В сравнении со случаями дикого типа PIK3CA, пациенты с мутацией в 9 и/или 20 экзонах показали значительно лучшую выживаемость без прогрессирования [лог-ранговый критерий P = 0.0089] и общую выживаемость (Критерий Кокса P = 0.012) [14].
В 2014 г. китайские генетики включили в исследование девяносто шесть послеоперационных образцов ПРП. Таргетная панель включала гены PIK3CA (экзоны 9 и 20), EGFR (экзоны 18, 19, 20 и 21), KRAS (экзоны 2 и 3) и BRAF (экзоны 11 и 15). Мутация PIK3CA была выявлена у 12 из 96 пациентов с ПРП (12.5 %). Мутаций в генах EGFR, KRAS или BRAF обнаружено не было. В итоге, была продемонстрирована корреляция между клинико-патогенетическими характеристиками и оценкой выживаемости при мутантном PIK3CA статусе. Интересен тот факт, что мутация чаще встречалась у женщин с ПРП (31.3 %, 5/16), чем у мужчин (8.8 %, 7/80), и у пациентов без метастазов в лимфатические лимфоузлы (4.4 %, 2/45, P = .025). Исследователи предположили, что определение статуса PIK3CА может быть перспективным в качестве предиктивного маркера [6].
В январе 2016 года в журнале Oncotarget была опубликована статья Song B. с соавт., с целью оценки статуса гена NOTCH1 в препаратах рака пищевода. Была обнаружена статистически значимая корреляция между мутациями NOTCH1 и PIK3CA в образцах ПРП. MtNOTCH1-статус был ассоциирован с ранними стадиями заболевания, высокой дифференцировкой опухолей, низкой частотой метастатического поражения регионарных лимфоузлов. Тем не менее пациенты с мутацией NOTCH1 хуже отвечали на лекарственное лечение и имели более низкие показатели общей выживаемости. В контраст этому пациенты с мутацией PIK3CA показывали лучший ответ на химиотерапию и более продолжительную выживаемость, по сравнению с пациентами без мутации PIK3CA. Эти данные представляют важную прогностическую значимость, однако имеют популяционную зависимость [14].
В исследовании, опубликованном в журнале Cancer Genomics Proteomics в мае 2016 года, осуществлялся поиск мутаций в генах TP53, PIK3CA, FBXW7 и KRAS с помощью панелей Ion PGM и AmpliSeq Cancer методом таргетного секвенирования. В результате исследования в 64 образцах было обнаружено 45 генов, связанных со злокачественными новообразованиями пищевода. Мутации гена TP53 определялись в 20.3 % (13/64) образцов, горячие точки локализовались в 5 экзоне (p. A159V, p. R175H, p. C176F, p. C275Y и p. H179R), 7 экзоне (p. S241F), 8 экзоне (p. C275Y, p. P278S и p. E298*) и 10 экзонах (p. R342*). Большее количество мутаций в гене TP53 было найдено в образцах ПРП, нежели в АП (22.9 % против 14.3 %, соответственно), однако, данная разница не была значимой (p=0.523). Частота мутаций в гене PIK3CA не зависела от пола, 18.5 % – среди мужчин и 21.6 % – среди женщин. Мутации гена PIK3CA были найдены в 3 из 64 образцов, что составило 4.7 %. Это были миссенс-мутации, расположенные в горячих точках 9 экзона: p.E542K и p.E545K. Два образца (3.1 %) содержали мутацию в гене FBXW7: одну в 8 экзоне (p. R465C) и одну в 9 экзоне (p. R505L). Интересно также то, что образец АП с мутацией FBXW7 p.A465C содержал две мутации в гене KRAS, одну во 2 экзоне (p. G13D) и одну в 3 экзоне (p. A59T). Глобально, был сделан вывод, что таргетное секвенирование является методом, способным достоверно определять мутационный статус отдельных опухолей, что позволяет использовать эту технологию в рутинной клинической практике.
Группой исследователей из различных клиник США был представлен отчёт о работе по определению различий и сходств распространенного плоскоклеточного рака и АП с помощью высокоразрешающего геномного профилирования [7, 2]. Так, в одном из исследований секвенирование нового поколения осуществлялось для всех кодирующих экзонов 315 генов, вовлечённых в канцерогенез. Результаты включали точечные мутации, короткие инсерции и делеции, амплификации генов, гомозиготные делеции. Клинически значимые геномные перестройки, имеющие связь с одобренными препаратами и находящимися на стадии оценки в тех клинических испытаниях, где определяющим фактором является механизм генетических изменений, были оценены в результате секвенирования. Средний возраст всех пациентов составил 63 года, гендерных различий отмечено не было. В 71 образце ПРП и 231 АП содержались различные геномные перестройки – 522 в ПРП (7.4 на образец) и 1,303 – в АП (5,6 на образец). Частота клинически значимых полиморфизмов при ПРП составила 94 % (2.6 на образец) и 93 % при АП (2.7 на образец). При АП наиболее часто встречались мутации в гене KRAS – 23 % АП против 6 % ПРП и мутации ERBB2 – 23 % АП против 3 % ПРП. ПРП в 24 % случаев был ассоциирован с мутациями в генах CRGA и PIK3CA по сравнению с АП (10%), мутации в гене PTEN составили 11 % при ПРП против 4 % при АП, мутации в гене NOTCH1 также чаще встречались при ПРП – 17 %. Другие перестройки, количество которых значительно варьировало в зависимости от типа опухоли, включали мутации в генах SMAD4 (14 % АП против 1 % ПРП), RB1 (14 % ПРП против 2 % АП), SOX2 (18 % ПРП против 1 % АП), и NFE2L2 (24 % ПРП против 1 % АП) [7].
Таким образом, клинически значимые мутационные профили значительно варьируют при АП и ПРП. Высокоразрешающее геномное профилирование повышает эффективность идентификации клинически значимых мутаций и при ПРП, и при АП, предполагая новые возможности для молекулярно-направленного лечения рака пищевода.