Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

PREPARATION OF PICHIA PASTORIS STRAIN PRODUCING RECOMBINANT CHIMERIC PROTEIN SUMO3-APOA-I AND A MATURE HUMAN APOA-I

Mamaev A.L. 1 Pykhtina M.B. 1 Beklemishev A.B. 1
1 Research Institute of Biochemistry
Целью настоящего исследования было получение рекомбинантного зрелого аполипопротеина А-I (apoA-I) человека. В результате работы был сконструирован рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий химерный полипептид, включающий с N-конца аминокислотную последовательность убиквитин-подобного белка SUMO3, а с С-конца – зрелого apoA-I человека. Установлено, что рекомбинантный химерный белок SUMO3-apoA-I с высокой эффективностью синтезировался в клетках дрожжей P. pastoris, секретировался в культуральную жидкость и не вызывал лизис клеток дрожжей, который происходил в случае прямой экспрессии гена зрелого apoA-I человека в клетках P.pastoris. Зрелый apoA-I получали с помощью ферментативного гидролиза химерного белка SUMO3-apoA-I SUMO3-специфичной протеазой SP2. Полученный рекомбинантный зрелый apoA-I человека по молекулярной массе соответствовал природному apoA-I, его чистота достигала 90 %, и общий выход составил около 400 мг/л.
The aim of this study was to obtain the mature recombinant human apolipoprotein A-I (apoA-I). As a result of the work the recombinant yeast strain Pichia pastoris, producing a chimeric polypeptide comprising amino acid sequence SUMO3 from N-terminus, and mature human ApoA-I at C-terminus, was constructed. It was found that the recombinant chimeric protein SUMO3-apoA-I was synthesized in the P. pastoris yeast cells with high efficiency, was secreted into the culture fluid and did not cause lysis of producer cells which was occurred in the case of direct gene expression of the mature human apoA-I. Mature ApoA-I was obtained by enzymatic hydrolysis of the chimeric protein SUMO3-apoA-I using SUMO-specific protease SP2. The molecular weight of the resulting mature recombinant human apoA-I corresponded to the molecular weight of natural apoA-I, the purity of the protein was 90% and the overall yield was about 400 mg / L.
cloning
gene expression
apoa-i
sumo3
pichia pastoris
producing strain

Аполипопротеин А-I (apoA-I) человека является основным белковым компонентом липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и имеет широкий спектр физиологических функций, включающих участие в регуляции метаболизма холестерина и уровня липидов в крови, а также обладающих противовоспалительными и антиокислительными свойствами. [5, 8]. Кроме того, apoA-I в составе ЛПВП осуществляет в организме транспорт витаминов, стероидных гормонов и различных ксенобиотиков [2]. Эти свойства apoA-I и ЛПВП делают их перспективными кандидатами в качестве антисклеротических препаратов, а также как природных переносчиков противоопухолевых препаратов гидрофобной природы, антибиотиков и диагностических агентов. Функциональная значимость ЛПВП и их белкового компонента apoA-I для терапевтических и исследовательских целей обусловливает необходимость разработки и совершенствования методов его получения.

Выделение apoA-I из сыворотки крови человека имеет ряд недостатков, таких как низкий выход белка, высокая стоимость из-за ограниченных объемов доступной донорской крови, опасность вирусной контаминации и другие, что не позволяет достичь промышленных объемов производства и существенно ограничивает применение нативного apoA-I в медицине. Получение рекомбинантного apoA-I человека методами генной инженерии представляется наиболее перспективным подходом к достижению крупномасштабного производства этого белка.

Получение рекомбинантного химерного apoA-I в клетках E. сoli зачастую характеризуются низким выходом белка и его загрязненностью эндотоксинами. С этой точки зрения получение рекомбинантого apoA-I в системе дрожжей Pichia pastoris представляет особый интерес, поскольку позволяет получать очищенные от эндотоксинов белки, секретируемые в культуральную жидкость и с гораздо большим выходом, чем в E. сoli. Feng M.Q. с соавт. получали рекомбинантный apoA-I в дрожжах Pichia pastoris, однако выход секретируемого белка apoA-I составил всего 90 мг на литр, что является недостаточным для промышленного производства [3].

В данной работе для получения зрелого apoA-I человека предлагается использовать рекомбинантный химерный белок SUMO3-apoA-I, включающий с N-конца аминокислотную последовательность убиквитин-подобного белка SUMO3 человека, слитую с С-конца с аминокислотной последовательностью зрелого белка apoA-I человека. Предполагается, что SUMO3-специфичная протеаза SP2 будет распознавать аминокислотную последовательность SUMO3 в N-концевой области химерного белка и осуществлять высокоспецифичный гидролиз пептидной связи между С-концевым аминокислотным остатком SUMO3 и N-концевым аминокислотным остатком целевого белка в составе химера.

Материалы и методы

Реактивы: акриламид, N,N’-метилен-бисакриламид, додецилсульфат натрия (SDS), персульфат аммония, N, N, N’, N’-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), бромфеноловый синий, 2-меркаптоэтанол, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), канамицин, агароза, изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) корпорации «Sigma-Aldrich» (США). Дрожжевой экстракт, пептон, агар фирмы «Difco» (Великобритания). Ni-NTA-сефароза 6В-CL, набор для выделения ДНК из агарозного геля фирмы «Qiagen» (США). Набор для ПЦР с полимеразой REDTaq фирмы «Sigma-Aldrich» USA. Набор для ПЦР с использованием высокоточной полимеразы Phusion (ThermoFisher Scientific USA). Набор для лигирования фрагментов ДНК c применением ДНК-лигазы фага T4 фирмы «Сибэнзим» (РФ, Новосибирск). ТХУ (трихлоруксусная кислота), фенол, хлороформ, этиловый, изоамиловый и изопропиловый спирты, кислоты, щелочи, соли квалификации «ХЧ» или «ОСЧ» производства «Реахим» (Россия). Эндонуклеазы рестрикции – от компании «Сибэнзим» (РФ, Новосибирск).

Штамм Escherichia coli: BL 21 (DE3) {F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])}.

Штамм Pichia pastoris: X-33

Плазмидные ДНК: рJ201 (DNA2.0, США), pPsecSUMO3 (Lifesensors, USA).

Методы

Проектирование синтетического гена apoA-I

Нуклеотидная последовательность синтетического гена apoA-I человека была спроектирована и оптимизирована по кодоновому составу для экспрессии в P. pastoris с использованием компьютерной программы «Gene designer» (фирма “DNA 2.0”, США). Кроме того, в проектируемом гене apoA-I человека были выявлены и заменены пары кодонов, которые, по данным [4], затрудняют или даже останавливают трансляцию мРНК. Оптимизированный ген зрелого белка АпоА1 был синтезирован и клонирован по сайтам рестрикции XhoI и SalI в составе коммерческого плазмидного вектора pJ201.

Конструирование рекомбинантной плазмиды pPsecSUMO3-apoA-I

Синтетический ген зрелого apoA-I был амплифицирован с вектора pJ201-apoA-I методом ПЦР с помощью термостабильной полимеразы Phusion. При амплификации использовали праймеры, достраивающие на 5’-концах 2-х цепей ампликона сайты рестрикции BsmBI и XbaI: праймер №1 5’-CAGCGTCTCTAGGTGATGAGCCACCACAGTC-3’ и праймер №2 CGTCTAGATCATTGCGTGTTTAACTTCTTAGTG-3’ Ампликон гена apoA-I гидролизовали эндонуклеазами рестрикции BsmBI и XbaI и с помощью ДНК-лигазы фага Т4 встраивали в плазмиду pPsecSUMO3, предварительно линеаризованную рестриктазой BsmBI. Полученной лигазной смесью трансформировали клетки E.coli BL21 (DE3). Отбор клонов, содержащих рекомбинантную плазмиду pPsecSUMO3-apoA-I, проводили на агаризованной среде LB, содержащей 50 мкг/мл зеоцина. Наличие целевой ДНК-вставки определяли методом ПЦР колоний. Клон, содержащий плазмиду pPsecSUMO3-apoA-I, использовали для её препаративной наработки.

Получение штамма дрожжей Pichia pastoris – продуцента рекомбинантного химерного белка SUMO3-apoA-I

Трансформацию компетентных клеток дрожжей Pichia pastoris шт. X-33 проводили плазмидой pPsecSUMO3-apoA-I, предварительно гидролизованной рестриктазой BstXI. Отбор трансформированных клонов осуществляли на селективной агаризованной среде ЛБ, содержащей 500 и 2000 мкг/мл зеоцина. Отобранные колонии дрожжей выращивали в течение 2 суток на орбитальном шейкере при 300 об/мин в среде BMGY, после чего вносили индуктор метанол до 0,5 %. По окончании индукции клетки осаждали центрифугированием при 3500 g в течение 20 мин при +4 0С. Белки из супернатантов осаждали 5 % ТХУ. Осадки промывали ацетоном и анализировали электрофорезом в SDS-ПААГ. Клон, продуцирующий наибольшее количество целевого химерного полипептида, отбирался для дальнейшей работы.

Получение химерного полипептида SUMO3-apoA-I

Клон продуцент химера SUMO3-apoA-I выращивали в 50 мл среды BMGY в течение 2 суток на орбитальном шейкере при 300 об/мин, после чего вносили индуктор метанол до 0,5%. На 4-е сутки после индукции клетки осаждали центрифугированием, а в супернатант вносили сульфат аммония до конечной концентрации 60 % от насыщения. Преципитаты белка осаждали центрифугированием при 14000 об/мин 20 минут при комнатной температуре. Полученный осадок, содержащий главным образом рекомбинантный химерный белок SUMO3-аpoA-I человека, растворяли в фосфатно-солевом буфере (PBS) и диализовали против PBS в течение ночи при +40C.

Гидролиз химера SUMO3-apoA-I с высвобождением зрелого аpoA-I человека

Для ферментативного гидролиза химерного белка SUMO3-apoA-I использовали ранее полученный нами фрагмент (240 а.о.) рекомбинантной SUMO3-специфичной протеазы SP2 (SP2f), содержащий аминокислотные остатки с 342 по 582 полноразмерного фермента (589 а.о.). Химерный белок SUMO3-аpoAI инкубировали с SP2f в PBS c 2 mM дитиотреитола в молярном соотношении химерный белок/фермент 200/1 в течение 3-х часов при +30 оС. Выделение и очистку зрелого белка apoA-I проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке со смолой Ni-NTA в нативных условиях.

Результаты и обсуждение

Конструирование рекомбинантной плазмиды pPsecSUMO3-apoA-I и получение штамма продуцента химерного белка SUMO3-apoA-I

Оптимизированный для экспрессии в Pichia pastoris ген зрелого apoA-I был клонирован в составе вектора pJ201. Полученная плазмида pJ201-apoA-I была использована в качестве ДНК-матрицы при амплификации гена зрелого apoA-I. Ампликон был клонирован в составе плазмиды pPsecSUMO3. Колонии, выросшие на селективной агаризованной среде ЛБ, содержащей 50 мкг/мл зеоцина, отбирали с помощью ПЦР с праймерами № 1 и № 2 на наличие целевых генов. Штамм дрожжей Pichia pastoris – продуцента рекомбинантного химерного белка SUMO3-apoA-I, получали путем трансформации дрожжей Pichia pastoris линеаризованной плазмидной ДНК pPsecSUMO3-apoA-I. Отбор рекомбинантных клонов проводили на агаризованной среде LB, содержащей антибиотик зеоцин в концентрации от 500 мкг/мл до 2000 мкг/мл. Отобранные клоны исследовали на способность продуцировать целевой рекомбинантный белок с помощью электрофореза лизата клеток, индуцированных метанолом. По результатам электрофореза был отобран клон, продуцирующий наибольшее количество рекомбинантного химерного белка SUMO3-apoA-I (около 600 мкг/мл культуральной жидкости).

Ранее мы исследовали прямую экспрессию зрелого гена apoA-I в клетках Pichia pastoris [1]. При таком варианте экспрессии наблюдалось появление в культуральной среде наряду с целевым белком множества белков, синтезируемых Pichia pastoris (рис.1,А). Это свидетельствовало о имеющем место лизисе дрожжевых клеток, обусловленном, по-видимому, мембранолитическим действием apoA-I. В случае получения белка SUMO3-apoAI лизиса дрожжевых клеток не наблюдалось и в культуральной жидкости присутствовал главным образом целевой белок SUMO3-apoAI (рис.1,Б).

Рис.1. Электрофореграмма белков культуральной жидкости, полученной при экспрессии генов зрелого белка аpoA-I человека и химерного полипептида SUMO3-аpoA-I в клетках P. pastoris. (А) М – маркёр молекулярных масс; 1 – экспрессия гена зрелого белка аpoA-I человека (Б) М – маркёр молекулярных масс; 1 и 2 – экспрессия гена химерного белка SUMO3-аpoA-I человека, 1 – образец культуральной жидкости, 2 – образец культуральной жидкости, сконцентрированной в 5 раз

Получение зрелого аполипопротеина A-I человека путем ферментативного гидролиза рекомбинантного химерного белка SUMO3-аpoA-I протеазой SP2f

Выращивание клеток клона-продуцента химера SUMO3-apoA-I и индукцию синтеза белка проводили, как описано в методах. Белок осаждали сульфатом аммония, полученный осадок растворяли и диализовали против PBS. Чистота полученного рекомбинантного химерного белка SUMO3-аpoA-I человека составляла не менее 85 % по результатам электрофоретического анализа (рисунок не представлен).

Зрелый аполипопротеин A-I человека получали путем ферментативного гидролиза рекомбинантного химерного белка SUMO3-аpoA-I протеазой SP2f. Эта протеаза распознаёт аминокислотную последовательность SUMO3 в N-концевой области химерного белка и осуществляет высокоспецифичный гидролиз пептидной связи между С-концевым аминокислотным остатком SUMO3 и N-концевым аминокислотным остатком целевого белка в составе химера [6, 7]. Как видно из рис. 2, с увеличением количества протеазы повышается эффективность гидролитического расщепления белка SUMO3-аpoA-I с образованием целевого зрелого аpoA-I человека. Для наиболее полного гидролиза необходимо практически эквивалентное количество протеазы, однако, даже при этих условиях гидролизу подвергается не более 70 % молекул химера. Необходимость в избыточном внесении фермента может быть связана с недоступностью сайта протеолиза в химерном полипептиде, обусловленной конформацией этого белка. В пользу такого заключения свидетельствуют результаты наших ранних экспериментов, в которых был продемонстрирован полный гидролиз химерного полипептида SUMO3-GFP низкими концентрациями этой же рекомбинантной протеазы (данные не представлены).

Рис.2. Электрофореграмма продуктов гидролиза химерного белка SUMO3-apoA-I протеазой SP2f. М – маркер молекулярных масс; К – контроль (химер SUMO3-apoA-I не подвергнутый гидролизу протеазой SP2f; (1-5) – химер SUMO3-apoA-I, гидролизованный разными количествами протеазы SP2f: (1) – однократным количеством, (2) – 2-х кратным, (3) – 3-х кратным, (4) – 6-ти кратным, (5) – 10-ти кратным

По данным электрофоретического анализа хроматографически очищенный рекомбинантный зрелый белок apoA-I по молекулярной массе (28,3 кДа) соответствовал природному apoA-I человека, его чистота составила не менее 90 % [рис. 3] с выходом около 400 мг/л.

Рис.3. Электрофореграмма образца рекомбинантного зрелого белка apoA-I человека, полученного на конечной стадии очистки. М – маркёр молекулярных масс; 1 – зрелый рекомбинантный apoA-I

Заключение

Получение нативного аполипопротеина А-I человека в промышленных масштабах является актуальной задачей медицинской биотехнологии. Существующие способы получения рекомбинантного apoA-I генно-инженерными методами с помощью экспрессии в клетках E. coli имеют существенные недостатки, такие как: загрязнение целевого белка бактериальными эндотоксинами, сложность, трудоёмкость и сравнительно высокая экономическая затратность процедуры выделения и очистки, а также, как правило, низкий выход конечного целевого белка.

В настоящей работе в целях получения зрелого рекомбинантного apoA-I человека была предпринята попытка создания штамма Pichia pastoris – продуцента химерного полипептида SUMO3-apoA-I. Предполагалось, что синтезированный химер за счёт сигнальной последовательности SUMO3 будет эффективно секретироваться в культуральную жидкость, а входящий в его состав apoA-I не будет вызывать лизиса клеток. Получение же зрелого apoA-I можно будет осуществлять с помощью гидролиза химера SUMO3-специфической протеазы.

Результаты экспериментов свидетельствуют, что рекомбинантный химер SUMO3-apoA-I высокоэффективно синтезировался в клетках дрожжей Pichia pastoris, секретировался в культуральную жидкость и не вызывал лизиса клеточных мембран штамма-продуцента. Гидролиз данного химера SUMO3-специфической протеазой позволил получить зрелый apoA-I человека, соответствующий по молекулярной массе нативному белку apoA-I. Для обеспечения протеолиза всех молекул химерного полипептида потребуются дополнительные исследования по подбору оптимальных условий реакции и оптимизации конструкции рекомбинантной SUMO3-специфической протеазы. Все это позволит существенно улучшить способ получения зрелого apoA-I человека, который будет положен в основу создания технологии промышленного производства белка для нужд медицины.