Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Цитокины и факторы роста, продуцируемые как самой опухолью, так и ИКК, составляющими ее микроокружение, играют важную роль в патогенезе злокачественных новообразований [1,7]. Благодаря своим разнообразным функциям, цитокины могут оказывать как проонкогенное действие, участвуя в поддержании воспаления и тем самым способствуя прогрессии опухоли, но и, будучи задействованными в различных молекулярно-биологических механизмах, демонстрируют и противоопухолевый эффект, непосредственно или косвенно влияя на дифференцировку, апоптоз опухолевых клеток [2, 3, 6, 8]. Поскольку цитокины относятся к факторам централизованной регуляции иммунных процессов во всем организме, их продукция иммунокомпетентными клетками крови так или иначе взаимосвязана с процессами, протекающими локально в месте развивающегося новообразования. Интерес представляет сравнительный анализ цитокинпродуцирующего потенциала клеток опухоли и цитокинпродуцирующего потенциала иммунокомпетентных клеток крови, который может быть выявлен при воздействии на них поликлональных активаторов (ПА).

Целью настоящего исследования явилось определение цитокинового профиля супернатантов клеток периферической крови, опухоли и ее микроокружения при воздействии на них поликлональных активаторов у больных инвазивным протоковым раком молочной железы.

Материал и методы исследования

Материалом исследования служила периферическая кровь и биоптаты опухолей 54 женщин с инвазивным протоковым раком, являющимся по гистологическому типу аденокарциномой. Для оценки цитокинпродуцирующего потенциала ИКК крови, опухоли и ее микроокружения применяли комплекс ПА, состоящий из фитогемагглютинина в концентрации 4 мкг/мл, конканавалина А в концентрации 4 мкг/мл и липополисахарида в концентрации 2 мкг/мл. В исследовании использовали стандартизованный набор реагентов «Цитокин-стимул-бест» производства ЗАО «Вектор-Бест». Одну часть клеток крови пациента инкубировали в питательной среде DMEM-F12 (для определения спонтанной продукции), а другую – в таком же объеме среды с комплексом ПА для определения индуцированной продукции цитокинов при 37 ºС в течение 24 ч, после чего клетки осаждали центрифугированием при 2000 об/мин, 15 мин, получали супернатант, в котором проводили определение концентрации цитокинов.

Биоптаты опухолей, полученные методом трепанобиопсии объемом 8 мм³, получали специальным устройством и помещали в 2 флакона, в одном из которых находилась только питательная среда DMEM-F12 (спонтанная продукция), а в другом – раствор ПА в таком же объеме среды (продукция, индуцированная ПА) [4]. После инкубирования при 37 ºС в течение 72 ч опухоль извлекали из среды и фиксировали в растворе формалина для дальнейших гистологических исследований. Для получения очищенного супернатанта оставшиеся клетки опухоли осаждали центрифугированием при 2000 об/мин, 15 мин. В супернатантах, после осаждения клеток крови и опухоли, с помощью иммуноферментного анализа определяли концентрацию IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-18, IL-1β, IL-1Ra, TNFα, IFNγ, G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), MCP-1 (моноцитарный хемотаксический протеин-1) с использованием наборов реагентов производства ЗАО «Вектор-Бест».

При определении концентрации ряда цитокинов было установлено, что их уровень находился на нижней границе чувствительности тест-системы. Это касается, в первую очередь, концентрации IL-2, IL-17 и IFNγ в супернатанте ИКК периферической крови. ИВПА на продукцию цитокинов ИКК крови, а также опухолью и ее микроокружением высчитывали по формуле: ИВПА = А/Б, где А − уровень стимулированной поликлональными активаторами продукции цитокина, Б − уровень спонтанной продукции цитокина.

Статистическую обработку данных выполняли с использованием непараметрического критерия Манна – Уитни. Показатели выражали в виде медианы – Me, нижнего и верхнего процентилей (25; 75), рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r) и его достоверность (p).

Результаты исследования и их обсуждение

Изучение влияния поликлональных активаторов (ПА) на продукцию цитокинов ИКК крови и опухоли у больных инвазивным протоковым раком показало достоверное повышения ИВПА на продукцию клетками крови почти всех цитокинов за исключением IL-18, по сравнению с клетками опухоли (табл. 1).

Таблица 1

Индекс влияния поликлональных активаторов на продукцию цитокинов клетками периферической крови и опухоли у больных с инвазивным протоковым раком

Такое различие обусловлено способностью опухоли и ее микроокружения продуцировать цитокины, что выражалось в изначально высоком уровне спонтанной продукции IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-18, IL-1Ra, IFNγ, G-CSF, GM-CSF и VEGF по сравнению со спонтанной продукцией ИКК крови (табл. 2).

Таблица 2

Спонтанная продукция цитокинов ИКК периферической крови и опухолью у больных с инвазивным протоковым раком молочной железы

При добавлении ПА в среду культивирования ИКК крови и опухоли в супернатанте последней отмечалось повышение продукции большинства цитокинов за исключением МСР-1, продукция которого осталась без изменений, и продукции VEGF, которая снизилась (табл. 3). Что касается влияния ПА на продукцию цитокинов ИКК крови, то была выявлена выраженная реакция клеток на ПА по сравнению с аналогичной реакцией опухоли и ее микроокружения (табл. 4). Так, концентрации цитокинов в супернатанте ИКК крови после добавления ПА достигали повышения на 1–2 порядка (табл. 5).

Таблица 3

Влияние поликлональных активаторов на продукцию цитокинов опухолью у больных с инвазивным протоковым раком

Таблица 4

Продукция цитокинов ИКК периферической крови и опухолью у больных с инвазивным протоковым раком молочной железы после воздействия поликлональных активаторов

Таблица 5

Влияние поликлональных активаторов на продукцию цитокинов периферической кровью у больных с инвазивным протоковым раком

Значительное повышение концентрации большинства цитокинов, продуцируемых ИКК крови после воздействия ПА, по сравнению с клетками опухоли, свидетельствовало о высоком цитокинпродуцирующем потенциале клеток периферической крови, в то время как клетки опухоли и ее микроокружения уже имели повышенный уровень спонтанной продукции цитокинов, которые обеспечивали ее рост и прогрессию [5, 7], поэтому активация ПА не давала такого увеличения их концентрации в супернатанте опухоли.

Выводы

Вышеизложенные данные объясняют более низкие значения ИВПА на продукцию цитокинов клетками опухоли по сравнению с ИКК крови. Дальнейшее изучение взаимосвязей цитокинпродуцирующего потенциала клеток крови и опухоли будет направлено на разработку способов определения тяжести опухолевой прогрессии по уровню цитокинов супернатанта клеток крови еще до проведения инвазивных процедур.