Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,931

CYTOKINE PATTERN OF SUPERNATANT OF BLOOD IMMUNOCOMPETENT CELLS AND TUMOR AT INVASIVE DUCTAL CARCINOMA OF THE BREAST

Kunts T.A. 1 Karpukhina K.V. 2 Mikhaylova E.S. 2, 1 Varaksin N.A. 3 Autenshlyus A.I. 1, 2
1 Novosibirsk State Medical University Ministry of health of Russia
2 Institute of molecular biology and biophysics
3 JSC «Vector-Best»
У больных инвазивным протоковым раком молочной железы проведен сравнительный анализ цитокинового профиля супернатантов клеток периферической крови и опухоли при воздействии на них поликлональных активаторов (ПА). Выявлено достоверное повышение индекса влияния поликлональных активаторов (ИВПА) на продукцию клетками крови изученных цитокинов за исключением IL-18 по сравнению с ИВПА на их продукцию клетками опухоли и ее микроокружения. Значительное повышение концентрации большинства цитокинов, продуцируемых иммунокомпетентными клетками (ИКК) крови после воздействия ПА, по сравнению с клетками опухоли свидетельствовало об их высоком цитокинпродуцирующем потенциале. Клетки опухоли и ее микроокружения уже имели повышенный уровень спонтанной продукции цитокинов, которые обеспечивали ее рост и прогрессию, поэтому активация ПА не давала такого увеличения их концентрации в супернатанте опухоли, что обусловливало более низкие значения ИВПА на продукцию цитокинов клетками опухоли по сравнению с ИКК крови.
Cytokine patterns of supernatants of peripheral blood cells and tumor exposed to polyclonal activators (PA) was investigated in patient with invasive ductal carcinoma of the breast, and comparative analysis was carried out. Significant increase of stimulation indexes of polyclonal activators (SIPA) for cytokine expression by blood cells, except IL-18, compared with SIPA for cytokine expression by tumor and its microenvironment were revealed. An increase in concentrations of most cytokines produced by blood immunocompetent cells exposured to PA, compared to tumor cells, demonstrated high cytokine-producing potential. Tumor and its microenvironment have already had increased levels of spontaneous production of cytokines that provided growth and progression of the tumor. Therefore, PA activation did not lead to such cytokine concentration increase in tumor supernatant. This could be the reason of lower values of SIPA on cytokine expression by tumor cells compared to blood immunocompetent cells.
cytokines
polyclonal activators
invasive ductal carcinoma
breast

Цитокины и факторы роста, продуцируемые как самой опухолью, так и ИКК, составляющими ее микроокружение, играют важную роль в патогенезе злокачественных новообразований [1,7]. Благодаря своим разнообразным функциям, цитокины могут оказывать как проонкогенное действие, участвуя в поддержании воспаления и тем самым способствуя прогрессии опухоли, но и, будучи задействованными в различных молекулярно-биологических механизмах, демонстрируют и противоопухолевый эффект, непосредственно или косвенно влияя на дифференцировку, апоптоз опухолевых клеток [2, 3, 6, 8]. Поскольку цитокины относятся к факторам централизованной регуляции иммунных процессов во всем организме, их продукция иммунокомпетентными клетками крови так или иначе взаимосвязана с процессами, протекающими локально в месте развивающегося новообразования. Интерес представляет сравнительный анализ цитокинпродуцирующего потенциала клеток опухоли и цитокинпродуцирующего потенциала иммунокомпетентных клеток крови, который может быть выявлен при воздействии на них поликлональных активаторов (ПА).

Целью настоящего исследования явилось определение цитокинового профиля супернатантов клеток периферической крови, опухоли и ее микроокружения при воздействии на них поликлональных активаторов у больных инвазивным протоковым раком молочной железы.

Материал и методы исследования

Материалом исследования служила периферическая кровь и биоптаты опухолей 54 женщин с инвазивным протоковым раком, являющимся по гистологическому типу аденокарциномой. Для оценки цитокинпродуцирующего потенциала ИКК крови, опухоли и ее микроокружения применяли комплекс ПА, состоящий из фитогемагглютинина в концентрации 4 мкг/мл, конканавалина А в концентрации 4 мкг/мл и липополисахарида в концентрации 2 мкг/мл. В исследовании использовали стандартизованный набор реагентов «Цитокин-стимул-бест» производства ЗАО «Вектор-Бест». Одну часть клеток крови пациента инкубировали в питательной среде DMEM-F12 (для определения спонтанной продукции), а другую – в таком же объеме среды с комплексом ПА для определения индуцированной продукции цитокинов при 37 ºС в течение 24 ч, после чего клетки осаждали центрифугированием при 2000 об/мин, 15 мин, получали супернатант, в котором проводили определение концентрации цитокинов.

Биоптаты опухолей, полученные методом трепанобиопсии объемом 8 мм3, получали специальным устройством и помещали в 2 флакона, в одном из которых находилась только питательная среда DMEM-F12 (спонтанная продукция), а в другом – раствор ПА в таком же объеме среды (продукция, индуцированная ПА) [4]. После инкубирования при 37 ºС в течение 72 ч опухоль извлекали из среды и фиксировали в растворе формалина для дальнейших гистологических исследований. Для получения очищенного супернатанта оставшиеся клетки опухоли осаждали центрифугированием при 2000 об/мин, 15 мин. В супернатантах, после осаждения клеток крови и опухоли, с помощью иммуноферментного анализа определяли концентрацию IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-18, IL-1β, IL-1Ra, TNFα, IFNγ, G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), MCP-1 (моноцитарный хемотаксический протеин-1) с использованием наборов реагентов производства ЗАО «Вектор-Бест».

При определении концентрации ряда цитокинов было установлено, что их уровень находился на нижней границе чувствительности тест-системы. Это касается, в первую очередь, концентрации IL-2, IL-17 и IFNγ в супернатанте ИКК периферической крови. ИВПА на продукцию цитокинов ИКК крови, а также опухолью и ее микроокружением высчитывали по формуле: ИВПА = А/Б, где А − уровень стимулированной поликлональными активаторами продукции цитокина, Б − уровень спонтанной продукции цитокина.

Статистическую обработку данных выполняли с использованием непараметрического критерия Манна – Уитни. Показатели выражали в виде медианы – Me, нижнего и верхнего процентилей (25; 75), рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r) и его достоверность (p).

Результаты исследования и их обсуждение

Изучение влияния поликлональных активаторов (ПА) на продукцию цитокинов ИКК крови и опухоли у больных инвазивным протоковым раком показало достоверное повышения ИВПА на продукцию клетками крови почти всех цитокинов за исключением IL-18, по сравнению с клетками опухоли (табл. 1).

Таблица 1

Индекс влияния поликлональных активаторов на продукцию цитокинов клетками периферической крови и опухоли у больных с инвазивным протоковым раком

Цитокин

Исследуемые группы

1. ИКК крови, n=66

2. Клетки опухоли и ее микроокружения, n=54

Me (25–75-й процентиль)

Me (25–75-й процентиль)

IL-2

7,90 (3,25; 14,83); p1-2=0,0001

1,88 (1,00; 4,40)

IL-6

59,95 (20,43; 250,19); p1-2=0,0001

2,26 (1,05; 2,79)

IL-8

24,15 (5,20; 58,90); p1-2=0,0001

1,60 (0,88; 2,47)

IL-10

40,80 (16,10; 64,30); p1-2=0,0001

1,27 (0,77; 2,73)

IL-17

23,10 (9,98; 51,35); p1-2=0,0001

1,30 (0,79; 3,50)

IL-18

1,30 (1,11; 1,41); p1-2=0,001

1,88 (1,15; 3,22)

IL-1β

39,71 (14,97; 94,35); p1-2=0,0001

11,28 (5,53; 38,03)

IL-1Ra

12,03 (8,05; 15,93); p1-2=0,0001

1,76 (0,99; 3,76)

TNFα

33,74 (5,86; 127,63); p=0,0001

3,43 (1,50; 7,61)

INFγ

168,15 (0,36; 600,30); p1-2=0,0001

1,24 (0,66; 2,86)

G-CSF

66,45 (20,71; 284,95); p1-2=0,0001

1,11 (0,96; 2,12)

GM-CSF

19,95 (7,64; 33,77); p1-2=0,0001

3,15 (1,50; 7,59)

VEGF

2,50 (1,70; 3,54); p1-2=0,0001

0,60 (0,40; 1,09)

MCP-1

1,29 (0,50; 2,83)

1,00 (0,51; 2,05)

 

Такое различие обусловлено способностью опухоли и ее микроокружения продуцировать цитокины, что выражалось в изначально высоком уровне спонтанной продукции IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-18, IL-1Ra, IFNγ, G-CSF, GM-CSF и VEGF по сравнению со спонтанной продукцией ИКК крови (табл. 2).

Таблица 2

Спонтанная продукция цитокинов ИКК периферической крови и опухолью у больных с инвазивным протоковым раком молочной железы

Цитокин

(пкг/мл)

Исследуемые группы

1. ИКК крови, n=66

2. Клетки опухоли и ее микроокружения, n=54

Me (25-75-й процентиль)

Me (25-75-й процентиль)

IL-2

2,00 (2,00; 2,00); p1-2=0,0001

2,00 (2,00; 3,08)

IL-6

160,50 (57,45; 515,60); p1-2=0,0001

45000,00 (28000,00; 64795,00)

IL-8

672,50 (348,75; 3757,50); p1-2=0,0001

24410,00 (14045,00; 38100,00)

IL-10

2,60 (1,00; 5,83); p1-2=0,0001

11,25 (5,33; 18,15)

IL-17

2,00 (2,00; 2,00); p1-2=0,0001

2,25 (2,00; 5,68)

IL-18

24,55 (18,95; 31,00); p1-2=0,0001

94,75 (42,63; 246,65)

IL-1β

39,90 (15,45; 96,35)

43,10 (21,60; 92,88)

IL-1Ra

557,50 (463,40; 939,78); p1-2=0,0001

9017,50 (2362,05; 18858,75)

TNFα

10,60 (3,58; 21,43)

12,00 (7,35; 22,93)

INFγ

2,00 (2,00; 2,00); p1-2=0,0001

10,35 (7,13; 23,63)

G-CSF

13,00 (2,00; 39,80); p1-2=0,0001

1982,50 (618,50; 2917,50)

GM-CSF

2,30 (2,00; 7,50); p1-2=0,0001

40,60 (17,75; 75,15)

VEGF

53,55 (32,15; 86,08); p=0,0001

2624,70 (1838,55; 4134,20)

MCP-1

2710,50 (1204,20; 7600,18)

3630,25 (1420,95; 8477,65)

 

При добавлении ПА в среду культивирования ИКК крови и опухоли в супернатанте последней отмечалось повышение продукции большинства цитокинов за исключением МСР-1, продукция которого осталась без изменений, и продукции VEGF, которая снизилась (табл. 3). Что касается влияния ПА на продукцию цитокинов ИКК крови, то была выявлена выраженная реакция клеток на ПА по сравнению с аналогичной реакцией опухоли и ее микроокружения (табл. 4). Так, концентрации цитокинов в супернатанте ИКК крови после добавления ПА достигали повышения на 1–2 порядка (табл. 5).

Таблица 3

Влияние поликлональных активаторов на продукцию цитокинов опухолью у больных с инвазивным протоковым раком

Цитокин

(пкг/мл)

Исследуемые группы, n=54

Спонтанная продукция

Продукция после воздействия ПА

Me (25–75-й процентиль)

Me (25–75-й процентиль)

IL-2

2,00 (2,00; 3,08);

p1-2=0,0001

5,00 (2,00; 9,55)

IL-6

45000,00 (28000,00; 64795,00);

p1-2=0,0001

103725,00 (31112,50; 153412,50)

IL-8

24410,00 (14045,00; 38100,00);

p1-2=0,014

41275,00 (16762,50; 60225,00)

IL-10

11,25 (5,33; 18,15)

13,35 (4,00; 37,00)

IL-17

2,25 (2,00; 5,68);

p1-2=0,001

5,60 (2,70; 14,50)

IL-18

94,75 (42,63; 246,65);

p1-2=0,001

236,25 (96,75; 462,68)

IL-1β

43,10 (21,60; 92,88);

p1-2=0,0001

595,00 (386,25; 901,25)

IL-1Ra

9017,50 (2362,05; 18858,75);

p1-2=0,0001

15782,35 (10660,00; 27491,25)

TNFα

12,00 (7,35; 22,93);

p1-2=0,0001

43,55 (17,50; 82,13)

INFγ

10,35 (7,13; 23,63);

p1-2=0,005

20,30 (8,78; 52,83)

G-CSF

1982,50 (618,50; 2917,50)

2763,00 (1276,65; 2919,75)

GM-CSF

40,60 (17,75; 75,15);

p1-2=0,0001

129,35 (58,13; 228,25)

VEGF

2624,70 (1838,55; 4134,20);

p1-2=0,001

1755,00 (899,30; 3108,90)

MCP-1

3630,25 (1420,95; 8477,65)

2710,00 (1440,30; 12552,75)

 

Таблица 4

Продукция цитокинов ИКК периферической крови и опухолью у больных с инвазивным протоковым раком молочной железы после воздействия поликлональных активаторов

Цитокин

(пкг/мл)

Исследуемые группы

1.        ИКК крови, n=66

2.     Клетки опухоли и ее микроокружения, n=54

Me (25–75-й процентиль)

Me (25–75-й процентиль)

IL-2

15,85 (6,50; 31,63); p1-2=0,0001

5,00 (2,00; 9,55)

IL-6

12675,00 (9287,50; 17587,50); p1-2=0,0001

103725,00 (31112,50; 153412,50)

IL-8

16775,00 (24450,00; 27562,50); p1-2=0,0001

41275,00 (16762,50; 60225,00)

IL-10

93,85 (63,30; 139,98); p1-2=0,0001

13,35 (4,00; 37,00)

IL-17

41,40 (18,43; 101,35); p1-2=0,0001

5,60 (2,70; 14,50)

IL-18

31,85 (25,28; 38,63); p1-2=0,0001

236,25 (96,75; 462,68)

IL-1β

1472,50 (1032,50; 2761,25); p=0,0001

595,00 (386,25; 901,25)

IL-1Ra

8067,90 (6073,30; 10121,70); p1-2=0,0001

15782,35 (10660,00; 27491,25)

TNFα

1069,00 (647,50; 1513,00); p1-2=0,0001

43,55 (17,50; 82,13)

INFγ

816,00 (306,08; 1328,68); p1-2=0,0001

20,30 (8,78; 52,83)

G-CSF

746,70 (621,60; 986,70); p1-2=0,0001

2763,00 (1276,65; 2919,75)

GM-CSF

84,35 (47,55; 129,45); p1-2=0,013

129,35 (58,13; 228,25)

VEGF

118,55 (87,80; 185,55); p1-2=0,0001

1755,00 (899,30; 3108,90)

MCP-1

4289,80 (3028,13; 5450,40)

2710,00 (1440,30; 12552,75)

 

Таблица 5

Влияние поликлональных активаторов на продукцию цитокинов периферической кровью у больных с инвазивным протоковым раком

Цитокин

(пкг/мл)

Исследуемые группы пациентов, n=66

Спонтанная продукция

Продукция после воздействия ПА

Me (25–75-й процентиль)

Me (25–75-й процентиль)

IL-2

2,00 (2,00; 2,00);

p1-2=0,0001

15,85 (6,50; 31,63)

IL-6

160,50 (57,45; 515,60);

p1-2=0,0001

12675,00 (9287,50; 17587,50)

IL-8

672,50 (348,75; 3757,50);

p1-2=0,0001

16775,00 (24450,00; 27562,50)

IL-10

2,60 (1,00; 5,83);

p1-2=0,0001

93,85 (63,30; 139,98)

IL-17

2,00 (2,00; 2,00);

p1-2=0,0001

41,40 (18,43; 101,35)

IL-18

24,55 (18,95; 31,00);

p1-2=0,001

31,85 (25,28; 38,63)

IL-1β

39,90 (15,45; 96,35);

p1-2=0,0001

1472,50 (1032,50; 2761,25)

IL-1Ra

557,50 (463,40; 939,78);

p1-2=0,0001

8067,90 (6073,30; 10121,70)

TNFα

10,60 (3,58; 21,43);

p1-2=0,0001

1069,00 (647,50; 1513,00)

INFγ

2,00 (2,00; 2,00);

p1-2=0,0001

816,00 (306,08; 1328,68)

G-CSF

13,00 (2,00; 39,80);

p1-2=0,0001

746,70 (621,60; 986,70)

GM-CSF

2,30 (2,00; 7,50);

p1-2=0,0001

84,35 (47,55; 129,45)

VEGF

53,55 (32,15; 86,08);

p1-2=0,0001

118,55 (87,80; 185,55)

MCP-1

2710,50 (1204,20; 7600,18)

4289,80 (3028,13; 5450,40)

Значительное повышение концентрации большинства цитокинов, продуцируемых ИКК крови после воздействия ПА, по сравнению с клетками опухоли, свидетельствовало о высоком цитокинпродуцирующем потенциале клеток периферической крови, в то время как клетки опухоли и ее микроокружения уже имели повышенный уровень спонтанной продукции цитокинов, которые обеспечивали ее рост и прогрессию [5, 7], поэтому активация ПА не давала такого увеличения их концентрации в супернатанте опухоли.

Выводы

Вышеизложенные данные объясняют более низкие значения ИВПА на продукцию цитокинов клетками опухоли по сравнению с ИКК крови. Дальнейшее изучение взаимосвязей цитокинпродуцирующего потенциала клеток крови и опухоли будет направлено на разработку способов определения тяжести опухолевой прогрессии по уровню цитокинов супернатанта клеток крови еще до проведения инвазивных процедур.