Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,931

MODULATING EFFECTS OF MODERATE HYPOTHERMIA ON THE STATE OF HEMOSTASIS AND MICROVASCULATURE IN RATS

Lycheva N.A. 1, 2 Shakhmatov I.I. 1, 2 Blazhko A.A. 1 Sedov A.V. 1
1 Altai State Medical University
2 FGBI "Institute of Physiology and Fundamental Medicine" SB RAMS
Цель: изучить состояние системы гемостаза и микроциркуляторного русла в гипотермический и постгипотермический периоды у крыс. Материалы и методы: в исследовании использовались крысы-самцы линии Вистар (30 особей). Животные экспериментальных групп подвергались однократному иммерсионному охлаждению в воде температурой 5 °С до достижения умеренной степени гипотермии, контрольная группа животных помещалась в воду температурой 30 °С. У животных 1-ой группы анализ состояния микроциркуляторного русла и забор крови осуществлялся сразу по достижении умеренной степени гипотермии. Во 2-ой группе – через 48 часов после прекращения охлаждения. Результаты и их обсуждение. Сразу по достижении умеренной степени гипотермии регистрировалась гипоагрегация и гиперкоагуляция на фоне увеличения перфузии тканей кровью. По истечении 2-х суток с момента прекращения охлаждения регистрировалась гиперагрегация и гиперкоагуляция, со стороны микроциркуляторного русла регистрировался вазоспазм.
Objective is to study the state of hemostatic system and the microvasculature in hypothermic and posthypothermic periods in rats. Materials and Methods: The study used male rats Wistar (30 animal units). Animals of experimental groups were exposed to single immersion cooling in water at a temperature of 5 ° C to achieve moderate hypothermia, the control group of animals was placed into water at 30 ° C. In the 1st group of animals analysis of the microvasculature and blood sampling was carried out immediately after reaching moderate hypothermia. In the 2nd group - 48 hours after cooling. Results and discussion. Immediately upon reaching moderate hypothermia, hypoaggregation and hypercoagulability associated with increased tissue perfusion of blood were recorded. In 2 days after cooling hyperaggregation and hypercoagulation were recorded, vasospasm was recorded in the microvasculature.
hypothermia
hemostasis
microcirculation

Гипотермия оказывает генерализованное воздействие на организм, выступая не только в качестве естественного фактора внешней среды, но и искусственно создаваемой среды, используемой в практической медицине. В практической медицине гипотермия является обязательным условием при проведении операций на открытом сердце [1, 5], а также важным компонентом комплексной терапии ряда неотложных состояний [6, 9, 10]. В формировании острой ответной реакции на холод вовлекаются все органы и системы. При этом основными компонентами, обеспечивающими адекватность трофики тканей, являются микроциркуляторное русло и система гемостаза. Показано, что действие гипотермии способствует развитию полиорганной недостаточности [7, 9, 12]. Немаловажным является изучение состояния микроциркуляторного русла и системы гемостаза в постгипотермический период, характеризующийся формированием и манифестацией травматических последствий действия общего переохлаждения на организм [12, 13]. Прогнозирование возможных нарушений со стороны микроциркуляторного русла и системы гемостаза, развивающихся после прекращения охлаждения, позволит минимизировать последствия повреждающего действия гипотермии на организм. Цель исследования: изучить состояние системы гемостаза и микроциркуляторного русла в различные периоды действия умеренной гипотермии у крыс.

Материал и методы исследования

Исследования выполнены на 20 крысах-самцах линии Wistar, массой 300 ± 15 г. Общая управляемая иммерсионная гипотермия моделировалась путем помещения животных в воду температурой 5 °С и воздуха 7 °С на фоне предварительной наркотизации, на станке фиксаторе. Критерием прекращения воздействия служило достижение экспериментальными животными ректальной температуры 27…30 °С, что соответствовало умеренной степени гипотермии. Время экспозиции было индивидуальным и составило 5 ± 3 минуты. Контролем служила кровь 10 животных, полученная после того, как они на фоне предварительной наркотизации в индивидуальных клетках помещались в воду температурой 30 °С и воздуха 22…25 °С. Время экспозиции соответствовало времени охлаждения животных опытной группы. В дальнейшем все животные были поделены нами на группы. У животных 1-ой группы анализ состояния микроциркуляторного русла и забор крови осуществлялся сразу по достижении умеренной степени гипотермии. Во 2-ой группе – через 48 часов после прекращения охлаждения.

У всех животных исследовались показатели тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза, а также антикоагулянтная и фибринолитическая активность плазмы крови с помощью наборов фирмы «Технология-Стандарт» (Россия). Индуцированную агрегацию тромбоцитов проводили по G.V.R. Born (1962) на агрегометре «Биола» (Россия), в качестве индуктора использовался раствор аденозиндифосфата АДФ концентрацией 10 мкг/мл. Тромбоэластометрия выполнялась на приборе «Rotem» (“Pentapharm GmbH”, Германия) с использованием реагента «Natem», в состав которого входит хлорид кальция. Кровь для исследования в объеме 5 мл получали путем забора из печеночного синуса в полистироловый шприц, содержащий 0,11 М (3,8 %) раствора цитрата натрия (соотношение крови и цитрата 9:1). Для изучения состояния микроциркуляторного русла использовалась лазерная доплеровская флоуметрия (ЛДФ). Методика ЛДФ проводилась на аппарате ЛАКК-02 (НПО Лазма, Россия), при этом регистрировали основные параметры микроциркуляции, а также проводили анализ амплитудно-частотного спектра колебаний кровотока. Головка оптического зонда фиксировалась в основании хвоста экспериментального животного. Длительность записи ЛДФ-граммы составила 7 минут.

До проведения эксперимента на протяжении недельной адаптации к условиям вивария все крысы находились в стандартных условиях содержания согласно требованиям GLP. Использование крыс в экспериментах осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по охране позвоночных животных, используемых в эксперименте и Директивами – 86/609/EEC. Обезболивание и умерщвление животных проводилось в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Сравнение полученных результатов осуществляли путем вычисления медианы (Ме) и процентилей (25 % и 75 %). Статистический анализ выполнен с использованием непараметрического критерия Манна – Уитни, на персональном компьютере с использованием пакета прикладных статистических программ Statistica 6.0 (StatSoft, США). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты исследования показателей системы гемостаза у животных контрольной и всех экспериментальных групп представлены в таблице 1.

Таблица 1

Показатели системы гемостаза у крыс в различные периоды постгипотермии

Параметр

Контроль

1-ая группа

2-ая группа

Тромбоциты, 109

511 [502÷554]

715 [704÷719] *

459 [402÷469]#

АДФ-индуцированная агрегация, отн.ед.

10,2 [6,7÷12,3]

1,26 [1,0÷5,12] *

23,8 [20,3÷24,9]*#

Фибриноген, г/л

2,1 [2,1÷2,2]

2,3 [1,8÷2,3]

2,6 [2,5÷2,7]*

РФМК, мг/100 мл

3,0 [3,0÷3,0]

3,0 [3,0÷3,0]

3,0 [3,0÷5,3]*#

ВПФМ, r

1,8 [1,6÷2,1]

1,2 [1,1÷1,3] *

0,89 [0,8÷1,1]*#

Антитромбин III, %

116,5 [114,0÷117,0]

70,0 [47,3÷100,0]*

103,2 [97,5÷115,4]#

Эуглобулиновый фибринолиз, мин

558,0

[360,0÷558,0]

1248 [1212,0÷1248,0]*

454,0

[400,0÷512,0]#

СТ, с

259,0

[227,0÷279,0]

218,0

[207,0÷236,0] *

179,5

[171,0÷181,0]*#

СFT, с

98,0

[82,0÷118,0]

102,0

[70,0÷103,0]

69,0

[60,0÷71,0]*#

ML, %

15,0

[0,0÷20,0]

5,0

[1,0÷9,0]*

15,0

[3,0÷24,0]#

Примечание: данные представлены в виде Ме – медиана выборки, [25÷75] – процентили выборки; * – статистически достоверная разница между исследуемой и контрольной группами (р<0,05, р<0,01), # – статистически достоверная разница между исследуемой и предшествующей экспериментальной группами (р<0,05, р<0,01); РФМК – растворимые фибрин-мономерные комплексы, ВПФМ – время полимеризации фибрин-мономерных комплексов, CT – время коагуляции, CFT – время формирования сгустка, ML –максимальный лизис.

Как следует из данных, представленных в таблице, сразу после прекращения охлаждения в кровотоке животных регистрировалось увеличение количества тромбоцитов на 39 % (р<0,05) при снижении их агрегационной способности в 8 раз (р<0,01). Кроме того, достижение умеренной степени гипотермии сопровождалось гиперкоагуляцией, которая подтверждалась как данными тромбоэластограммы (показатель СТ уменьшался на 16 %, р<0,05), так и укорочением времени полимеризации фибрин-мономерных комплексов на 35 % (р<0,05). Зафиксированная гиперкоагуляция усугублялась выраженным (на 40 %, р<0,05) снижением активности антитромбина III на фоне угнетения фибринолитической активности плазмы крови в 2 раза (р<0,01). Через 48 часов после прекращения охлаждения в кровотоке животных регистрировалось снижение количества тромбоцитов на 35 % (р<0,05), при увеличении их агрегационной способности в 18 раз от показателя зафиксированного сразу после прекращения охлаждения (р<0,05). Гиперкоагуляция, зарегистрированная у экспериментальных животных 1-ой группы, сохранялась. Кроме того, регистрировалось увеличение количества фибриногена, сопровождавшееся ростом концентрации РФМК. Состояние животных усугублялось значимым укорочением времени образования сгустка (на 31 %, р<0,05) и времени полимеризации фибрин-мономерных комплексов (на 30 %, р<0,05).

Результаты исследования показателей микроциркуляторного русла, зарегистрированные в указанные периоды гипотермии у крыс, представлены в таблице 2.

Таблица 2

Показатели микроциркуляторного русла у крыс в различные периоды постгипотермии

Параметр

Исходно

1-ая группа

2-ая группа

ПМ, пф.ед.

6,6 [4,2÷8,5]

11,6 [10,7÷13,5] *

1,9 [1,8÷3,6]*#

СКО (σ), пф.ед.

3,1 [2,1÷4,2]

6,54 [4,6÷9,1] *

1,8 [1,4÷3,1]*

Эндотелиальные волны, пф.ед.

9,01 [4,5÷18,1]

14,9 [10,1÷22,1] *

8,09 [2,1÷8,5]#

Вазомоторные волны, пф.ед.

10,04 [3,5÷17,1]

12,7 [10,6÷20,5] *

7,5 [2,1÷8,09]#

Дыхательные волны, пф.ед.

7,2 [2,7÷11,2]

8,89 [5,1÷15,3] *

1,74 [1,1÷3,9]*#

Пульсовые волны, пф.ед.

3,25 [1,4÷4,7]

4,3 [2,7÷5,6]

0,71 [0,6÷1,6]*#

Примечание: данные представлены в виде Ме – медиана выборки, [25÷75] – процентили выборки; * – статистически достоверная разница между исходными и регистрируемыми параметрами (р<0,05, р<0,01), # – статистически достоверная разница между исследуемой и предшествующей экспериментальной группами (р<0,05, р<0,01); ПМ – показатель микроциркуляции, СКО (σ) – флакс, среднеквадратичное отклонение амплитуд колебаний кровотока.

При оценке состояния микроциркуляторного русла сразу после прекращения охлаждения было зафиксировано увеличение в 2 раза (р<0,01) показателей микроциркуляции и флакса. Со стороны активных механизмов контроля микроциркуляции было установлено увеличение амплитуд эндотелиальных волн в 1,5 раза (р<0,01) и незначительное увеличение амплитуд вазомоторных волн на 25 % (р<0,05). Также регистрировалось увеличение дыхательных волн на 23 % (р<0,05). По истечении 2 дней после прекращения охлаждения регистрировалось резкое снижение показателя микроциркуляции в 3,5 раза (р<0,01). Кроме того, регистрировалось уменьшением амплитуд эндотелиальных и вазомоторных волн на 50 % и 40 % (р<0,05) соответственно. Кроме того, регистрировалось снижение амплитуд дыхательных и пульсовых волн в 5 и 6 раз соответственно (р<0,01).

Таким образом, в ходе достижения умеренной степени гипотермии у животных развивается вазодилатация, обусловленная как возможным первичным действием наркоза на прекапилляры, так и выбросом в кровоток оксида азота, в результате интенсификации кровообращения и увеличения напряжения сдвига на сосудистую стенку [8, 11, 12]. Выбросом оксида азота объясняется увеличение амплитуды эндотелиальных волн и снижение агрегационной активности тромбоцитов. На фоне развития вазодилатации увеличивается объем крови в микроциркуляторном русле, что сопровождается увеличением показателя микроциркуляции. Увеличение флакса обусловлено более интенсивным функционированием механизмов активного контроля микроциркуляции и свидетельствует о глубокой модуляции кровотока [10]. Увеличению показателя флакса также способствует рост амплитуды дыхательных волн, вызванный в свою очередь как увеличением микроциркуляторного давления, так и развившейся вазодилатацией. На фоне роста показателя микроциркуляции увеличение амплитуды дыхательных волн свидетельствует о снижении тонуса венулярных сосудов, об ухудшении оттока крови и развитии застойных явлений в микроциркуляторном русле [6, 7]. Развитие неблагоприятных гемодинамических сдвигов у экспериментальных животных в данный период усугубляется развитием гиперкоагуляционных изменений со стороны системы гемостаза. Множество клинических работ характеризует гипотермию как фактор развития тромбоза у пострадавших [2, 3, 4, 10]. Так, при исследовании людей, подвергшихся гипотермическому воздействию, отмечено развитие полицитемии и гиперкоагуляционных сдвигов, обусловленных гемоконцентрацией вследствие увеличения проницаемости сосудов [2, 6, 8]. При исследовании крыс, достигших ректальной температуры +28...+32°С, регистрируется возросшая концентрация PAI, оказывающего протромботический эффект, максимальная концентрация которого достигается при +31 °С [10]. Аналогичные изменения были обнаружены в экспериментах на мышах при охлаждении до +31 ºС. В ходе экспериментов было показано значимое увеличение концентрации PAI-1, что расценивалось как возросший риск развития тромбоза у экспериментальных животных [3, 10]. Также, при общей непреднамеренной гипотермии у людей, достигших +30 °С в течение 30 минут, отмечено угнетение активности t-PA, сопровождающееся депрессией фибринолиза [10]. В то же время описанные протромботические изменения в системе гемостаза являются целесообразной реакцией организма. Так, при гипотермии происходит «физиологическая ампутация» с последующим развитием ишемических поражений в переохлажденных конечностях, гиперкоагуляционный статус и депрессия фибринолиза обеспечивают отграничение пораженного участка, в то время как гипоагреация способствует сохранению реологических свойств крови при развившейся гемоконцентрации.

В клиническом течении гипотермии выделяют постгипотермический период, характеризующийся формированием и манифестацией травматических последствий действия общего переохлаждения на организм. По статистическим данным самое большое число летальных исходов регистрируется в первые 48 часов после возращения температуры тела к нормальным значениям [9, 10].

По истечении 2-х суток с момента прекращения охлаждения нами зарегистрировано выраженное снижение амплитуд волн всех частотных диапазонов, что свидетельствует о развитии массивного вазоспазма [12, 13]. На фоне предварительного охлаждения развитие вазоспазма уменьшает несоответствием между потребностью в кислороде и объемом поступающего кислорода к тканям, что показано в исследованиях на собаках и на людях [11, 13]. Увеличение тонуса и развитие спазма сосудов объясняется возросшей симпатической импульсацией в постгипотермическом периоде, вызванной активацией стресс-реакции, это приводит к увеличению напряжения в гладкомышечных клетках сосудистой стенки. Сформировавшийся спазм приводит к обеднению нутритивного кровотока, развитию ишемии и снижению показателя перфузии. Первичное нарушение микроциркуляции, способствующее увеличению сопротивления току крови, вследствие вазоспазма, является причиной вторичных нарушений в системе гемостаза. Вазоспазм, ишемические явления, а также непосредственное действие гипотермии на организм стимулируют выброс в кровоток провоспалительных цитокинов, обладающих мощным прокоагулянтным действием [3, 7]. Так, показано, что в первые 24–48 часов регистрируется максимально возможный уровень фактора некроза опухоли (TNFα), интерлейкинов 6 и 18 (IL-6, IL-18), обладающих мощным прокоагулянтным действием [2, 7]. Дополнительным стимулятором процессов свертывания крови является развивающийся в постгипотермическом периоде ацидоз [13]. В нашем исследовании активация системы свертывания подтверждается развитием состояния тромботической готовности у экспериментальных животных, которое характеризуется гиперагрегацией, гиперкоагуляцией, появлением в кровотоке растворимых фибрин-мономерных комплексов и укорочением времени их самосборки. Кроме того, по данным тромбоэластограммы регистрировалось укорочение времени образования сгустка. В пользу предположения о развитии острой фазы воспалительной реакции говорит начальное увеличение концентрации фибриногена.

Выводы:

  1. Достижение умеренной степени гипотермии оказывает выраженное модулирующее влияние на систему микроциркуляции. Сразу по достижении указанной степени гипотермии наблюдалось развитие вазодилатации, свидетельствующее о декомпенсаторном состоянии экспериментальных животных.
  2. Превентивная терапия для улучшения гемостазиологической картины в постгипотермический период должна быть направлена на профилактику тромботических осложнений.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16-34-60054 мол_а_дк