Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,931

EVALUATION OF THE ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF L- AND D-ASCORBIC ACID ISOFORMS AND THEIR SALTS WITH CHITOSAN

Al Zubeydi A.F. 1 Malinkina O.N. 1 Chemodurova A.A. 1 Ksenofontova O.Y. 1 Zudina I.V. 1
1 Saratov State University
Оценивали антибактериальную активность (Аi) L- и D-изоформ аскорбиновой кислоты и их солей с хитозаном (ХТЗ) в отношении грамотрицательных и грамположительных бактериальных штаммов методом диффузии в агар. Были использованы L- и D-аскорбиновая кислота, чда, и ХТЗ со средневязкостной молекулярной массой 32 кДа и степенью деацетилирования 70 мольн. % (ЗАО «Биопрогресс», РФ). Самые высокие значения антибактериальной активности наблюдались у L-аскорбиновой кислоты (Аi = 45,7 %) и у полисоли гидрохлорид-D-аскорбата ХТЗ (Аi = 54,7 %) в отношении грамотрицательного тест-штамма Е. coli 113-13. По всей видимости, стерические особенности органического лиганда имеют решающее значение для установления полноценного взаимодействия протонированных аминогрупп ХТЗ с сайтами связывания на поверхности клеток грамотрицательных и грамположительных бактерий.
The antibacterial activity (Аi) of the L- and D-isoforms of ascorbic acid and their salts with chitosan (CHs) against some Gram-negative and Gram-positive bacterial strains was evaluated using the agar diffusion method. L- and D-ascorbic acids, analytical grade, and CHs (Bioprogress Ltd., RF) with a viscosity-averaged molecular weight of 32 kDa and a degree of deacetylation of 70 wt. % were used. The highest levels of antimicrobial activity were observed for L-ascorbic acid (Аi = 45.7 %) and the CHs hydrochloride-D-ascorbate•polysalt (Аi = 54.7 %) against the Gram-negative test-strain E. coli 113-13. Apparently, some steric features of the organic ligand are critical for the establishment of strong interaction between the protonated amino groups of CHs and the binding sites on the cell surface of the Gram-negative and Gram-positive bacteria.
chitosan
l- and d-ascorbic acid isoforms
antibacterial activity

В последние годы в отечественной литературе опубликован целый ряд статей об успешном опыте применения лекарственных препаратов, включающих в свой состав аскорбат хитозана – соль аминополисахарида хитозана (ХТЗ) и аскорбиновой кислоты (АК) [1, 2]. Как известно, ХТЗ обладает ранозаживляющим, противовоспалительным и биоцидным (антибактериальным, противовирусным и фунгицидным) действием [8, 9], что является крайне важным, в частности, при лечении воспалительных заболеваний пародонта и ран различного генеза. Выбор АК в качестве органического лиганда в составе соли обусловлен прежде всего ее способностью определять нормальное течение репаративных процессов за счет стимуляции синтеза коллагена и пролиферации фибробластов.

Одной из особенностей соли аскорбата ХТЗ является то, что она образована из двух оптически активных химических соединений. Аминополисахарид ХТЗ проявляет оптическую активность вследствие наличия асимметрично замещенных атомов углерода в глюкопиранозных циклах макромолекул. Асимметрический атом углерода в фурановом кольце молекулы АК обусловливает существование двух оптических энантиомеров – право- и левовращающего изомера, условно именуемых L- и D-изоформами. Причем, в природных объектах АК находится исключительно в биологически активной L-изоформе (витамин С), тогда как при химическом синтезе, как правило, получается рацемат – смесь равных количеств L- и D-изоформ. В отношении D-АК в литературе имеются отдельные экспериментальные данные о ее слабой коллагенстимулирующей активности и низкой скорости поступления в организм [10]. В этой связи вполне логично было бы ожидать, что препараты, содержащие АК в виде смеси L- и D-стереоизомеров, могут существенно отличаться своими фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами, и это не может не отразиться на эффективности проводимого лечения.

Известно также, что стереоизомеры лекарственных веществ могут существенно различаться своим терапевтическим эффектом, и не всегда он оказывается благоприятным. Так, например, D-соталол оказывает антиаритмическое действие, а L-соталол является альфа-блокатором; D-этамбутол используется в качестве противотуберкулезного препарата, в то время как прием L-этамбутола приводит к слепоте. Поэтому само существование явления стереоизомеризма лекарственных веществ инициировало развитие целого направления исследований в области клинической фармакологии, основной целью которого является сравнение эффективности и безопасности как отдельных энантиомеров, так и их рацемической смеси [7].

Не так давно было установлено, что взаимодействие ХТЗ с АК пространственно отличается от его взаимодействия с другими органическими или неорганическими кислотами [5]. Вопрос о влиянии хиральности АК на биологическую активность полимера ХТЗ остается практически не изученным.

Данная работа посвящена сравнению антибактериальной активности L- и D-изоформ АК и их солей с ХТЗ.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования служили водные растворы L- и D-изоформ АК, а также водные растворы их солей с ХТЗ. В качестве исходных субстанций использовали L- и D-аскорбиновую кислоту (C6H8O6) производства ООО «Люми» (г. Санкт-Петербург) и ЗАО «Вектон» (г. Санкт-Петербург), соответственно, аналитической степени чистоты, а также порошок водорастворимого хитозана (ХТЗ) со средневязкостной молекулярной массой 32 кДа и степенью деацетилирования 70 мольн.% (ЗАО «Биопрогресс», г. Щелково). Проведенный дополнительный химический анализ коммерческого порошка ХТЗ показал, что он представлен полисолью гидрохлорида ХТЗ (ХТЗ·HCl). Навески ХТЗ·HCl предварительно стерилизовали в ламинарном боксе NUAIRE Biological Safeti Cabinets (Франция) в течение 15 мин. При приготовления растворов использовали стерильную дистиллированную воду, дегазированную от CO2 и О2 кипячением при 100 °С в течение 1 часа.

Исходные 9 %-ные растворы L- и D-изоформ АК получали растворением навесок L- и D-АК в воде при 20 ± 2 оС в отсутствие естественного освещения. Исходные растворы гидрохлорида-аскорбата ХТЗ (ХТЗ·HCl·АК) готовили порционным смешиванием твердой навески ХТЗ·HCl с 9 %-ным водным раствором L- или D-АК в количестве, обеспечивающем мольное соотношение ХТЗ·HCl : АК = 1 : 0.6. В эксперименте использовали суточные растворы L- и D-АК и их солей ХТЗ·HCl·D-АК и ХТЗ·HCl·L-АК.

Антибактериальную активность полученных препаратов определяли методом, разработанным С. Е. Есиповым с соавторами [3]. Для этого в застывшем мясопептонном агаре, содержащем взвесь клеток суточной бактериальной тест-культуры (108 к.т. в 1 мл по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича), делали шесть лунок диаметром 7 мм по окружности чашки Петри на расстоянии 30–33 мм от центра (рисунок). В три лунки (через одну) вносили по 0.1 мл контрольного препарата (стандарта) – 0.05 %-ного раствора хлоргексидина биглюконата (производство ООО «Южфарм», РФ). В три другие лунки вносили по 0.1 мл водных растворов L- и D-изоформ АК или растворов солей ХТЗ·HCl·D-АК и ХТЗ·HCl·L-АК в разведениях, указанных в таблице. На каждый испытуемый препарат брали по пять чашек с тест-культурами Staphylococcus aureus 209P и Escherichia coli 113-13. Для лучшей диффузии испытуемых препаратов в питательную среду чашки с нанесенными образцами сначала выдерживали в течение 2-х часов при комнатной температуре, а затем помещали в термостат на 37 оС. Зоны задержки роста бактерий замеряли через 18–20 часов культивирования. Эксперимент повторяли троекратно.

Зоны угнетения роста культуры S. aureus 209P водными растворами соли ХТЗ·HCl·L-АК концентрации 9 (1), 4.5 (2), 2.25 % (3) и стандартом – 0.05 %-ным раствором хлоргексидина биглюконата

Антибактериальную активность (Аi, %) анализируемых образцов рассчитывали в точном соответствии с тем, как это указано в статье [4]. Все вычисления и статистическую обработку данных проводили с помощью программ Microsoft Excel (пакет ПО Microsoft Office 2010) и StatSoft Statistica v6.0 Rus (2006).

Результаты исследования и их обсуждение

Предложенный С.Е. Есиповым с соавт. [3] и модифицированный В.М. Игидбашян с соавт. [4] математический алгоритм обработки данных позволяет рассчитывать величину антибактериальной активности Аi относительно опорной концентрации какого-либо стандарта, то есть антибиотика или антисептика, биоцидная активность которого известна. В данной работе в качестве стандарта был выбран 0.05 %-ный раствор хлоргексидина биглюконата, применяющийся в медицине в качестве асептического средства для лечения ран, потертостей, трещин, ожогов, бактериальных и грибковых заболеваний кожи и слизистых оболочек.

В таблице приведены значения Аi исследуемых растворов в отношении тестовых культур двух видов микроорганизмов – грампозитивного S. aureus 209P и грамнегативного E. coli 113-13. Важно отметить, что во всех экспериментах коэффициент корреляции ri2 имел величину не менее 0.99, что свидетельствовало о наличии линейной зависимости между логарифмом дозы препарата, внесенной в лунки питательного агара, и диаметром зон подавления роста. Следовательно, указанные в таблице значения Аi были определены с относительной ошибкой не более 5 % [3].

Значения антибактериальной активности (Ai) водных растворов L- и D-изоформ аскорбиновой кислоты (АК) и их солей с гидрохлоридом хитозана (ХТЗ·HCl), рассчитанные относительно 0.05%-ного раствора биглюконата хлоргексидина, ri2=0.99

Раствор

Разведе-

ние

Staphylococcus aureus 209P

Escherichia coli 113-13

Диаметр зон, мм

dst

Ci

Ai,%

Диаметр зон, мм

dst

Ci

Ai,%

L-АК

1

17.6

20.0

0.3684

36.4

18.2

20.0

0.4570

45.7

2

14.8

15.4

4

12.2

12.8

D-АК

1

15.4

20.0

0.1699

17.0

16.4

20.0

0.2459

24.6

2

13.0

13.8

4

10.8

11.4

ХТЗ·HCl·L-АК

1

14.0

20.0

0.0924

9.2

13.6

20.0

0.0727

7.3

2

11.8

11.4

4

10.0

9.6

ХТЗ·HCl·D-АК

1

17.0

20.0

0.2920

29.2

18.8

20.0

0.5469

54.7

2

14.2

16.0

4

11.6

13.2

_________________________

Примечание. dst – среднее значение диаметра зон подавления роста контрольным стандартным раствором для девяти измерений; Ci – экспериментально определенное значение концентрации препарата в трех разведениях анализируемого образца относительно концентрации контрольного стандартного раствора.

При сравнении значений величины Аi у стереоизоформ АК было установлено, что биоцидная активность раствора L-АК по сравнению раствором D-АК была выше и в отношении штамма E. coli 113-13 (в 1.9 раза, p ≤ 0.05), и в отношении S. aureus 209P (в 2.1 раза, p ≤ 0.05). Иная картина наблюдалась при воздействии на культуры бактерий растворов солей стереоизоформ АК и ХТЗ·HCl. Оказалось, что раствор ХТЗ·HCl·L-АК по сравнению с раствором ХТЗ·HCl·D-АК был в 3.2 раза менее активен в отношении культуры S. aureus 209P (p ≤ 0.05) и в 7.5 раза – в отношении E. coli 113-13 (p ≤ 0.05).

При сравнении антибактериальной активности стереоизомеров АК и соответствующих им полимерных солей было установлено, что антибактериальная активность D-АК была статистически значимо ниже по сравнению с ХТЗ·HCl·D-АК: в отношении S. aureus 209P – в 1.7 раза; в отношении E. coli 113-13 – в 2.2 раза. В то же время, значения Аi у L-АК были существенно выше таковых у ХТЗ·HCl·L-АК: в 6.3 раза (p ≤ 0.05) в отношении E. coli 113-13 и в 4.0 раза (p ≤ 0.05) в отношении S. aureus 209P.

Более чувствительным к действию растворов стереоизомеров АК оказался грамнегативный микроорганизм E. coli 113-13. Значения величины антибактериальной активности в отношении этого штамма у растворов L-АК и D-АК были, соответственно, в 1.3 раза (p ≥ 0.05) и в 1.5 раза (p ≤ 0.05) выше, чем таковые в отношении грампозитивного S. aureus 209P. Статистически значимых различий в чувствительности к биоцидному действию растворов ХТЗ·HCl·L-АК у тестируемых культур установлено не было. Отношение значений Аi, рассчитанных для S. aureus 209P и для E. coli 113-13, у этой полисоли составляло величину 1.3 (p ≥ 0.05). В то же время, к действию растворов ХТЗ·HCl·D-АК штамм E. coli 113-13 проявлял бóльшую чувствительность по сравнению с S. aureus 209P – в 1.9 раза, причем p ≤ 0.05.

Заключение

Проведенное микробиологическое исследование продемонстрировало существенное изменение биоцидных свойств раствора комплексной соли гидрохлорида-аскорбата ХТЗ в зависимости от знака удельного оптического вращения стереоизомера АК, использованного при ее приготовлении. Из всех протестированных нами растворов самой высокой антибактериальной активностью обладала соль ХТЗ·HCl·D-АК. Это вполне согласуется с опубликованным ранее наблюдением, что наибольшую биологическую активность проявляют растворы солей ХТЗ, имеющие малое по модулю отрицательное значение удельного оптического вращения [6]. Как показали А. Б. Шиповская с соавт. (2015), водные растворы ХТЗ·HCl в L-АК и D-АК имеют отрицательные значения [α], причем кривая дисперсии удельного оптического вращения раствора ХТЗ·HCl·D-АК (мольное соотношение ХТЗ·HCl:АК – 1:2) в большей степени смещена в область, где величина [α] приближается к 0 [5].

Большинство исследователей склоняются к мнению, что антибактериальная активность у ХТЗ определяется положительно заряженными аминогруппами (–NH3+) мономерных звеньев макроцепи аминополисахарида, которые обеспечивают связывание полимера с анионными компонентами поверхностных структур клеток микроорганизмов [8, 9]. В этом случае главной мишенью для ХТЗ у грамотрицательных бактерий становится отрицательно заряженный липополисахарид, у грамположительных – тейхоевые кислоты с многочисленными отрицательно заряженными остатками фосфорной кислоты. В наших экспериментах наиболее высокие значения антибактериальной активности были отмечены у L-стререоизомера АК (Аi = 45.7 %) и у ХТЗ·HCl·D-АК (Аi = 54.7 %) в отношении грамнегативного микроорганизма E. coli 113-13. Физическая сущность наблюдаемого нами явления, к сожалению, пока не имеет объяснения, и требуются дополнительные исследования. Можно лишь предположить, что стерические особенности органического лиганда являются критичными для установления полноценного взаимодействия протонированных аминогрупп ХТЗ с сайтами связывания на поверхности клеток грамнегативных и грампозитивных микроорганизмов.