Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК): язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК) – одна из самых значимых проблем современной гастроэнтерологии. Постоянный рост заболеваемости, инвалидизация населения, а также большая распространенность подавляющего числа случаев среди трудоспособного населения в возрасте 20–40 лет, делает данную группу заболеваний социально значимой [2]. БК – это рецидивирующее системное воспалительное заболевание, которое может поражать любую часть гастроинтестинального тракта, сопровождаться экстраинтестинальными проявлениями и ассоциированными иммунными нарушениями [16]. ЯК – это хроническое воспалительное заболевание слизистой оболочки толстой кишки неизвестной этиологии с развитием в ней язвенно-некротических изменений, локализованное преимущественно в ее дистальных отделах, поражающее первоначально прямую кишку с последующим распространением в проксимальном направлении и в 10 % случаев захватывающее всю толстую кишку (редко – с рефлюксным леотифлитом); протекает с различными местными и системными осложнениями и внекишечными проявлениями [12].
Распространенность ЯК в мире составляет 4–20 случаев на 100000 населения, в России – 1,7 случаев на 100000 населения. Распространенность БК в мире составляет 2–8 случаев на 100000 населения, в России – 0,3 случая на 100000 населения [1, 2].
Считается, что БК возникает в результате взаимодействия внешних и внутренних факторов. Происходит местное повреждение тканей кишечника и, как следствие, развитие локального воспаления в различных отделах ЖКТ. Генетически детерминированность способности иммунной системы регулировать воспалительные реакции подтверждена установленной связью между системой главного комплекса гистосовместимости (HLA) и БК. Зачастую в основе патогенеза БК лежат иммунные механизмы, которые несут ответственность за состояние эпителиального барьера кишечной стенки. Согласно лимфатической теории, первичные изменения развиваются в лимфатических узлах брыжейки и лимфоидных фолликулов кишечной стенки, что ведет к лимфатическому отеку подслизистого слоя, завершающемуся деструкцией и гранулематозом кишечной стенки [3].
Этиология язвенного колита до конца не изучена. Существует генетическая предрасположенность к НЯК (семейные случаи язвенного колита). Имеются данные о связи НЯК с антигеном DR2 и В27 комплекса гистосовместимости HLA. В патогенезе имеют значение изменения иммуногистологической реактивности, дисбиотические сдвиги, аллергические реакции, генетические факторы, нервно-психические нарушения, большое значение придают аутоиммунизации. Последнее можно подтвердить обнаружением при язвенном колите аутоантител, характером клеточного инфильтрата, который отражает реакцию ГЗТ. Также обнаруживают трофические расстройства в связи с выраженной деструкцией интрамурального нервного аппарата кишки. Активно исследуется роль при ЯК и БК условно-патогенной микрофлоры, которая непрерывно стимулирует иммунную систему кишечника и приводит к возникновению местной аллергической реакции [6, 9, 10, 11, 22].
Отсутствие четких представлений об этиологии и патогенезе ЯК и БК приводит к проблемам в диагностике и в большей степени в лечении ВЗК даже при наличии широкого спектра применяемых лекарственных средств. Течение БК и ЯК приводит к тяжелым осложнениям, в 1,5 раза увеличилась частота формирования патологического процесса в раннем возрасте, появились более тяжелые внекишечные проявления, чаще наблюдается развитие резистентности к традиционной терапии, ранняя инвалидизация пациентов, что требует разработки новых терапевтических подходов [2, 13]. Экспериментальное моделирование патологии человека является актуальной проблемой современной медицины и эффективно используется для разработки новых терапевтических подходов [8]. Для апробации новых лекарственных средств с патогенетически обоснованным механизмом действия возникает необходимость в моделировании ЯК и БК.
Цель работы – провести критический анализ данных об известных методах экспериментального моделирования БК и ЯК, индексированных в рецензируемых источниках баз данных Pubmed и Российского индекса научного цитирования за период 2006-2015 гг. Выявить наиболее оптимальную экспериментальную модель ЯК и БК по клинической, морфологической, иммунологической, гематологической картине. Важными требованиями к моделям ЯК и БК являются простота, скорость постановки и низкая стоимость.
Моделирование ЯК. Можно выделить два основных подхода при моделировании как ЯК, так и БК.
1. В последние 10–20 лет разработаны экспериментальные модели ВЗК, которые развиваются спонтанно у мышей с определенным генотипом или в результате воздействия на геном (нокаутные, трансгенные мыши) и ассоциированы с утратой иммунной толерантности к аутологичной кишечной микрофлоре.
Утрата компонентов эпителия кишечника (кератин 8-дефицитные мыши), слизи (муцин 2-дефицитные мыши), транспортного белка (мыши с дефицитом гена 1а множественной лекарственной резистентности). ВЗК этой группы развиваются при воздействиях на адаптивную иммунную систему и вызывают активацию эффекторной функции CD4+ Т-лимфоцитов. Одной из таких моделей являются STAT4 трансгенные мыши (STAT4 – фактор транскрипции, который активирует гены иммунного ответа типа Th1 с увеличением продукции IFN-γ). У мышей этой линии после дополнительной активации иммунной системы антигеном гемоцианином через 7–14 дней развивается энтероколит с глубоким трансмуральным воспалением и плотным инфильтратом CD4+ T-клеток, продуцирующих IFN-γ и ФНО-α. Перенос активированных бактериальными антигенами CD4+ T-клеток этих мышей иммунодефицитным реципиентам вызывал развитие колита.
Другие варианты ВЗК этого типа наблюдаются при стимуляции роста незрелых и зрелых лимфоцитов, их дифференцировки c развитием патогенной эффекторной функции, в частности, при высокой экспрессии ИЛ-7 (ИЛ-7-трансгенные мыши) или лиганда CD40 на лимфоцитах (СD40-лигандтрансгенные мыши), который активирует клетки, несущие рецептор CD40 («наивные» Т-клетки, B-клетки, макрофаги, моноциты) с увеличением продукции провоспалительных цитокинов. В последнем случае развивалось мультиорганное воспаление, включая энтероколит, который воспроизводился при переносе CD4+ T-клеток от больных мышей [18].
Выключение сигнальных молекул, ведущее к нарушению баланса между про- и противовоспалительными цитокинами (A20-дефицитные мыши, STAT73–/–-дефицитные мыши) и др. В течение 5–12 недель у мышей развиваются различные по локализации и тяжести варианты энтероколита или колита с инфильтрацией стенки кишечника иммунокомпетентными клетками (нейтрофилы, CD4+ T-клетки, B-клетки и др.) и увеличением продукции провоспалительных цитокинов IFN-γ, ФНО-α, ИЛ-1, ИЛ-12, хемокинов и их рецепторов [18].
2. Химически индуцированные модели с использованием декстрана сульфата натрия (ДСН), тринитробензолсульфоновой кислоты (ТНБС) и динитробензолсульфоновой кислоты (ДНБС), 4 % и 10 % уксусной кислоты [14, 15, 20, 23].
Учитывая низкую стоимость и быстроту постановки, химически индуцированные модели являются предпочтительными в экспериментальных исследованиях ВЗК. Безусловно, каждая модель характеризуется рядом ограничений и недостатков наряду с достоинствами и преимуществами, исходя из этого возникает необходимость сравнительного анализа экспериментальных моделей:
2.1. Модель с введением ДСН – одна из наиболее часто используемых при моделировании ЯК у грызунов. Поглощение мышами 3–10 % ДСН, растворенного в питьевой воде, в течение 7–10 дней индуцирует клинические признаки ЯК: потерю веса, кровавую диарею; морфологические признаки: укорочение ободочной кишки, изъязвление слизистой оболочки, уменьшение числа бокаловидных клеток, крипт и их глубины, инфильтрацию лимфоцитами, плазмоцитами и гистоцитами. [15]. Модель достаточно удобна для исследования эффективности лекарственных препаратов, изучения механизмов эпителиальной регенерации, влияния врожденного иммунитета на гомеостаз слизистых оболочек и исследования роли ЯК в развитии интестинальной дисплазии и аденокарциномы.
2.2. Альтернативой использованию ДСН является модель с введением ДНБС. Она подразумевает ректальное введение 100 мг/кг ДНБС, предварительно растворенного в 50 % спирте этиловом, присутствие которого необходимо для улучшения проникновения веществ через эпителий в собственную пластинку слизистой оболочки кишечника. Данная модель ассоциирована с такими клиническими и морфологическими проявлениями, как кровавая диарея, потеря веса, истончение кишечной стенки, изъязвление слизистой оболочки, уменьшение количества крипт, нейтрофильная инфильтрация. Однако указанные морфологические признаки локализуются преимущественно в дистальном отделе кишечника, что характерно больше для БК, а не для ЯК [15, 19, 23].
2.3. Введение ТНБС при моделировании ЯК очень схоже с моделью с использованием ДНБС. Ректально вводится 100 мг/кг вещества, предварительно растворенного в 50 % спирта этилового. Морфологическая картина модели также более характерна для БК, чем для ЯК [23].
2.4. Следующая модель подразумевает индуцирование ЯК ректальным введением на глубину 8 см 1 мл 4 % уксусной кислоты. Использование уксусной кислоты при моделировании ЯК – один из наиболее широко применяемых методов моделирования. В результате введения уксусной кислоты в полость кишечника наблюдаются клинические признаки: кровавая диарея, потеря веса; морфологические признаки: интенсивный воспалительный ответ, характеризующийся масштабным кровотечением, очаговыми изъязвлениями, истончением кишечной стенки, уменьшением количества крипт, нейтрофильной инфильтрацией [21]. Ректальное введение уксусной кислоты для моделирования ЯК возможно и в 10 % концентрации, но в меньшем объеме – 0,5 мл. В результате наблюдаются клинические признаки интоксикации, диарея с примесью слизи и крови, снижение массы тела животных; морфологические признаки: выраженная гиперемия и отек слизистой оболочки, интенсивные кровоизлияния, многочисленные участки некроза [4].
Однако у рассмотренных нами моделей существует и ряд недостатков:
- Широкая вариабельность концентраций при пероральном использовании ДСН приводит к невозможности контроля объема поглощенного раствора животными и массы поступившего в ЖКТ ДСН. Это приводит к разнородности повреждений слизистой стенки кишечника по глубине и площади распространения. Следствием является широкий разброс результатов эксперимента.
- Применение ДНБС и ТНБС воспроизводит клиническую картину ЯК, однако симптомы могут варьировать в зависимости от используемых животных, частоты введения, дозы ДНБС и ТНБС. По всем признакам использование ДНБС и ТНБС лучше воспроизводит БК, а не ЯК [17]. Неоспоримым преимуществом ДНБС и ТНБС по сравнению с ДСН является низкая стоимость.
- Использование 4 % уксусной кислоты, помимо хорошей воспроизводимости признаков ЯК, удобства и простоты метода, характеризуется доступностью вещества и экономическим преимуществом. Введение 10 % уксусной кислоты приводит к развитию выраженных деструктивных изменений слизистой стенки кишечника, что часто приводит к осложнениям в виде кишечных кровотечений, перфорации стенки и перитониту, что увеличивает частоту летальных исходов.
Моделирование БК. Наряду сЯК БК целесообразно моделировать с использованием химически индуцированных моделей в связи с их доступностью и относительной простотой. Несмотря на схожесть изучаемых патологий, при моделировании БК присутствуют некоторые особенности.
- Модель с использованием 1–3 % раствора ДСН, растворенного в питьевой воде, поглощаемого животными в течение 7 дней, применима не только для постановки ЯК, но и для БК с характерными клиническими проявлениями: кровавая диарея, потеря веса, морфологическими проявлениями: эрозии слизистой оболочки, уменьшение количества крипт, присутствие большого количества лимфоцитов, нейтрофилов и макрофагов в подслизистой оболочке. Достоинством данной модели является возможность продемонстрировать поверхностные повреждения в острой, хронической стадии и в стадии ремиссии. Однако использование ДНС не позволяет в полной мере воспроизвести морфологические признаки (трансмуральное воспаление и некроз в стенке кишечника) при БК. В этом отношении предпочтительно использование ДНБС или ТНБС [17].
- Использование ДНБС для моделирования БК подразумевает ректальное введение 15–30 мг вещества, предварительно растворенного в 50 % этаноле через катетер длиной 8 см. Преимуществом является стремительное формирование уже на третьи сутки после введения вещества признаков воспаления, изъязвлений преимущественно в дистальном отделе кишечника, что характерно для БК. Клинические признаки включают потерю веса, кровавую диарею, морфологические признаки – истончение кишечной стенки, изъязвление слизистой оболочки, адгезия кишечника к близлежащим органам (мочевой пузырь), инфильтрация лимфоцитами и нейтрофилами, уменьшение количества крипт, обширный отек в дистальной части кишечника; иммуногистохимически выявляется повышение активности миелопероксидазы в лейкоцитах, инфильтрирующих стенку кишечника. Хотя для всех моделей БК характерно явное проявление разрушений кишечной стенки, Применение ДНБС и ТНБС по сравнению с другими агентами более точно воспроизводит морфологическую картину БК, наблюдаемой у человека. Использование ДНБС в моделировании БК экономически более выгодно в сравнении с ТНБС, что является важным преимуществом при выборе экспериментальной модели [17, 20]. В целом, модель БК с использованием ТНБС отличается простотой и быстротой проведения эксперимента, может быть использована у разных видов животных (крысы, мыши, свиньи, кролики). Применение ДНБС позволяет более точно рассчитать массу поглощенного вещества, обеспечивает меньший разброс результатов эксперимента, уменьшает разнородность результатов проведенного эксперимента в сравнении с использованием ДНС, а также экономически более выгодно в сравнении с ТНБС [23].
- ТНБС при моделировании БК вводится ректально в дозе 10 или 30 мг вещества, растворенного в 50 % этаноле, через катетер, длиной 8 см. Максимальный объем вводимого раствора составляет для половозрелой крысы 1 мл. В течение 24, 48, 72 часов после введения вещества наблюдались такие клинические признаки, как потеря веса, кровавая диарея, уменьшение аппетита [5]. Большая потеря веса наблюдалась у животных, которым было введено 30 мг вещества, чем у животных с введением 10 мг [23]. При вскрытии животных на 10 день эксперимента были отмечены морфологические признаки БК: трансмуральное воспаление с макрофагальной инфильтрацией, обширными язвами по всей длине сегмента, контактирующего с веществом (8 см), разрушение тканей; иммуногистохимические признаки: увеличение экспрессии IL-6, IL-1, TNF-α.
Таким образом, наиболее оптимальным подходом для моделирования ЯК является ректальное введение 4 % уксусной кислоты. Наиболее удобным и приемлемым подходом для моделирования БК является ректальное введение ДНБС.