Интерес к изучению микроокружения клеток злокачественных новообразований и в том числе к тумор-ассоциированным макрофагам (tumor-associatedmacrophages) (ТАМ) сохраняется на протяжении последних десятилетий [1,2,4,7,12,13,14]. По современным представлениям ТАМ играют ключевую роль в туморогенезе и прогрессии рака. Посредством секреции многочисленных медиаторов, таких как: факторы роста (bFGF, GM-CSF, TGF-α, IGF-I, PDGF, VEGF/VPF, TGF-β), цитокины и монокины (IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α, субстанция P, простагландины, интерфероны, тромбоспондин 1), протеазы (ММР-2, ММР-9) ТАМ способны вызывать пролиферацию опухолевых клеток, ремоделировать строму, индуцировать ангиогенез, стимулировать инвазию и метастазирование опухоли [9].
В литературе имеется небольшое количество работ, посвященных прогностическому значению ТАМ при ПКР. Высокое содержание ТАМ в опухоли, по данным некоторых авторов, при раке почки коррелирует с возникновением метастазов [5,8]. По данным TogeH. и соавт. [11] высокое число ТАМ в карциномах было взаимосвязано с развитием рецидивов. В то же время Hutterer G.C. и соавт. [6] показали, что присутствие TAM в опухоли было статистически значимо ассоциировано с благоприятными прогностическими параметрами, включая низкую клиническую стадию, малый размер опухолевого узла, негативные лимфатические узлы и низкую градацию опухоли по Fuhrman. При этом 5-летняя послеоперационная выживаемость пациентов с высокими значениями TAM в опухоли составляла 93,5 %, по сравнению с 72,5 % в группе больных с отсутствием TAM в опухоли.
Таким образом, работы, посвященные изучению прогностическому значению исследования ТАМ при ПКР, немногочисленны и противоречивы, и поэтому данный элемент микроокружения опухоли нуждается дальнейшем изучении.
Целью работы стало исследование значения ТАМ при ПКР, поиск взаимосвязей с важными клинико-анатомическими факторами прогноза и послеоперационной выживаемостью больных.
Материал и методы исследования
Изучен операционный материал 56 больных ПКР. Средний возраст пациентов составил 58,8±1,1 лет. Мужчин было 27 (48,2 %), женщин – 29 (51,6 %). Во всех наблюдениях ПКР был классифицирован в соответствии с классификацией ВОЗ 2004 г. По гистологическому строению опухоли были представлены следующим образом: светлоклеточный рак – 42; папиллярный рак –3; хромофобный рак – 9; веретеноклеточный (саркоматоидный) рак –2.
Степень распространенности опухолевого процесса оценивалась в соответствии с TNM классификацией злокачественных опухолей (TNM Classification of Malignant Tumors, edited by Sobin L.H., 2002) [10]. Среди больных Ι клинической стадии (T1N0M0) соответствовали 35 (62,5 %) наблюдений; ΙΙ стадии (T2N0M0) -10 (17,9 %) наблюдений; ΙΙΙ стадии (T1N1M0, T2N1M0, T3N0M0, T3N1M0) - 9 (16,1 %) и ΙV стадии (T4N0M0, T4N1M0, TлюбаяN2M1, TлюбаяNлюбаяM1) – 2 (3,5 %). Степень злокачественности опухолевых клеток оценивали по Fuhrman S.A. и соавт. [3]. Степени анаплазии G1 соответствовали 16 опухолей (28,6 %), степени анаплазии G2 – 20 (35,7 %) опухолей, степени анаплазии G3 - 14 (25 %) и степени анаплазии G4 – 6(10,7 %).
Карцином с регионарными и отдаленными метастазами было 8 (14,3 %), локализованных опухолей было – 48 (85,7 %).
Средний размер опухолевого узла составил - 6,8±0,3 см.
Контролем служила ткань почек, забранная из максимально удаленных от опухоли участков, без выраженных явлений воспаления и склероза.
Материал фиксировали в 10 % раствором нейтрального забуференного формалина в течение 12–24 часов. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином и на кислые мукополисахариды коллоидным железом по Гале. ТАМ выявляли иммуногистохимическим методом с помощью моноклональных мышиных антител CD68 (клон PG-M1, DAKO) по рекомендованному производителем протоколу. Высчитывали среднее количество ТАМ в 3 полях зрения при увеличении микроскопа х 400.
Сведения о выживаемости больных получали по данным регистра злокачественных заболеваний и амбулаторных карт (за 2010–2016 гг.).
Статистическую обработку материала проводили при помощи статистического пакета Statistica 6.0. При нормальном распределении данных при проверке статистических гипотез применяли методы параметрической статистики (t-test Стьюдента), а если полученные данные не соответствовали критериям нормального распределения (критерий Шапиро – Уилка W = 0,89, p <0,01), то применяли тест Колмогорова – Смирнова или U-тест Манна – Уитни. Данные считали достоверными при р < 0,05. Построение кривых выживаемости проводили по методу Kaplan-Meier, достоверность различий показателей выживаемости оценивали с помощью log-rank теста.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты проведенного исследования показали, что в неизмененной ткани почки макрофаги имели круглую, овальную или отросчатую форму и располагались в интерстициальной ткани, возле сосудов, между канальцами и в почечных клубочках. В среднем число макрофагов в интерстициальной ткани почки составило 1,6±0,3 в 3 полях зрения при увеличении микроскопа х 400. В клубочках макрофаги имели отросчатую или вытянутую форму. В среднем содержание макрофагов в клубочках составило 5,3±1,2.
Среди всех больных ПКР вне зависимости от пола, возраста, гистологического типа и других клинико-морфологических прогностических показателей разброс средних значений плотности распределения ТАМ колебался от 1 до 137. Среднее значение плотности распределения ТАМ при ПКР составило 14,8±1,2.
Сопоставление среднего числа ТАМ в строме опухоли c прогностически важными клинико-анатомическими факторами ПКР позволило выявить некоторые корреляционные взаимосвязи. Плотность распределения ТАМ была взаимосвязана: c клинической стадией заболевания (r = 0,28; p = 0,04), c размером опухолевого узла (r = 0,29; p = 0,03), c наличием регионарных и дистантных метастазов (r = 0,46; p = 0,0001), со степенью анаплазии опухоли по Fuhrman (r = 0,58; p = 0,0001) и с послеоперационной выживаемостью больных (r = - 0,31; p = 0,02). Не было обнаружено взаимосвязей с полом (r = - 0,10; p = 0,45), возрастом (r = - 0,15; r = 0,27) больных и гистологическим вариантом опухоли (r = - 0,02; p = 0,87) (табл. 1).
Таблица 1
Корреляционные взаимосвязи плотности распределения ТАМ с клинико-морфологическими параметрами ПКР
|
Клинико-морфологическийпараметр |
Коэффициент корреляции (r) |
Достоверность (р) |
|
Клиническая стадия |
0,28 |
0,04 |
|
Размер опухолевого узла |
0,29 |
0,03 |
|
Наличие регионарных и дистантных метастазов |
0,46 |
0,0001 |
|
Степень анаплазии опухоли по Fuhrman |
0,58 |
0,0001 |
|
Послеоперационная выживаемостьбольных |
- 0,31 |
0,02 |
|
Пол пациентов |
- 0,10 |
- |
|
Возраст пациентов |
- 0,15 |
- |
|
Гистологический вариант опухоли |
- 0,02 |
- |
Среднее значение ТАМ в опухолях у мужчин составило 15,9±1,3, у женщин –13,5±2,1(p = 0,3).
В зависимости от возраста пациентов средние показатели числа ТАМ составили: у больных в возрасте от 30 до 39 лет – 8,3±1,45; от 40 до 49 лет – 15,5±2,5; от 50 до 59 лет – 16,4±2,7; от 60 до 69 лет –16,0±1,65и от 70 до 79 лет – 4,7±0,4. Таким образом, самые высокие показатели ТАМ в строме опухоли наблюдали в возрастной группе больных от 50 до 59 лет, а самые низкие в группе от 70 до 79 лет.
При анализе содержания ТАМ в зависимости от клинической стадии заболевания по TNM получены следующие результаты: у пациентов с I стадией среднее число ТАМ составило 12,3±1,6; при II стадии число ТАМ возрастало до 14,1±1,9 (p = 0,3); при III стадии количество ТАМ увеличивалось до 23,4±3,2(p = 0,002) и в IV стадии оно равнялось 21,5± 2,7(p = 0,18). Таким образом, при III и IV клинических стадиях отмечали увеличение ТАМ по сравнению с I и ІІ стадиями.
В зависимости от гистологического варианта ПКР наибольшее количество ТАМ было обнаружено в веретеноклеточной карциноме (45,8±18,7), а наименьшее значение имел хромофобный рак – 9,2±2,1. Промежуточное положение занимали светлоклеточный (14,6±1,2) и папиллярный (13,0±1,6) раки. Таким образом, наибольшее число ТАМ выявляли в веретеноклеточном варианте рака, а наименьшее в хромофобном.
При сопоставлении степени ядерной атипии по Fuhrmanс числом ТАМ были получены следующие результаты: при GI число ТАМ составило7,8±0,7, при GII-7,7±0,9(р = 0,9), при GIII оно возрастало до 26,2±3,2(p = 0,0000001) и при GIV равнялось -26,9±3,7 (p = 0,9). Таким образом, обнаружена тенденция к возрастанию числа ТАМ при увеличении степени анаплазии клеток опухоли.
При размере опухолевого узла < 7,0 см число ТАМ в опухоли равнялось 12,5±1,5, а при размере ≥ 7,0 см оно достоверно увеличивалось до 19,1±1,9(p = 0,01).
В локализованных опухолях содержание ТАМ составило 11,6±0,9, а при возникновении метастазов оно достоверно возрастало до 31,4±4,8 (p = 0,0000001) (табл. 2) (рис.1; а,б).
Таблица 2
Содержание ТАМ в опухоли в зависимости от клинико-морфологических параметров ПКР
|
Клинико-морфологический параметр |
Количество ТАМ |
Достоверность (р) |
|
Пол: мужчины женщины |
15,9±1,3 13,5±2,1 |
- |
|
Возраст: 30 – 39 лет 40 – 49 лет 50 – 59 лет 60 – 69 лет 70 – 79 лет |
8,3±1,45 15,5±2,5 16,4±2,7 16,0±1,65 4,7±0,41 |
p = 0,005 - - - |
|
Стадия TNM: І стадия ІІ стадия ІІІ стадия ІV стадия |
12,3±1,61 14,1±1,9 23,4±3,2 21,5± 2,7 |
- p = 0,002 - |
|
Гистологический вариант опухоли: хромофобный папиллярный светлоклеточный веретеноклеточный |
9,2±2,11 13,0±1,6 14,6±1,2 45,8±18,7 |
- - P = 0,000005 |
|
Градация по Fuhrman: GІ GІІ GІІІ GІV |
7,8±0,7 7,7±0,9 26,2±3,2 26,9±3,7 |
- - p = 0,0000001 |
|
Размер опухолевого узла: < 7,0 см ≥ 7,0 см |
12,5±1,5 19,1±1,9 |
p = 0,01 |
|
Метастазы: отсутствуют имеются |
11,6±0,9 31,4±4,8 |
p = 0,0000001 |
Рис. 1. Содержание ТАМ в строме опухоли в зависимости от наличия метастазов: a – локализованная опухоль; б – метастатическая опухоль. Иммуногистохимическое окрашивание на CD68, увеличение х 400
Для оценки отдаленных результатов 5-летней послеоперационной выживаемости больных в зависимости от среднего числа ТАМ в опухоли, новообразования нами были разделены на 2 группы. 1-ю группу составили карциномы с малым числом ТАМ (<13), 2-ю группу составили карциномы c большим числом ТАМ (≥ 13). При анализе по Каплан – Мейеру было обнаружено, что когда число ТАМ в опухоли составляло <13, то кумулятивная доля выживших к 1800 дню составила 0,96 (96 %), а когда количество ТАМ в опухоли составляло ≥ 13, то кумулятивная доля выживших к 1800 дню снижалась до 0,63 (63 %). При сравнении выживаемости групп больных с использованием логарифмического рангового критерия было получено, что различия данных достоверны (log-rankp = 0,001) (рис. 2).
Рис. 2. Кумулятивная пропорция 5-летней выживаемости больных ПКР в зависимости от числа ТАМ в опухоли
Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что число ТАМ в опухоли было взаимосвязано с рядом прогностически важных клинико-анатомических факторов ПКР и поэтому данный параметр может быть использован в качестве дополнительного фактора прогноза. Увеличение количества ТАМ в опухоли можно рассматривать как критерий вероятного возникновения метастазов. Выявлена взаимосвязь между числом ТАМ и выживаемостью больных. Высокий уровень содержания ТАМ является неблагоприятным фактором 5-летней послеоперационной выживаемости больных при ПКР.