Следствием различных видов физических нагрузок, как у юных спортсменов, так и спортсменов высокой квалификации является активация свободнорадикального окисления (СРО), что расценивается как универсальный механизм реагирования организма [14]. Однако интенсивность и продолжительность повышения СРО имеют определенную зависимость от уровня тренированности, аэробных возможностей организма, характера физических нагрузок (вид, интенсивность, частота, продолжительность), преобладающих механизмов энергообеспечения мышечной работы [16, 6]. Актуальным является вопрос об управлении свободнорадикальными процессами с целью профилактики и коррекции их негативных последствий. В организме существует многоуровневая система (клеточная и внеклеточная; ферментативная и неферментативная), контролирующая СРО. К регуляторам широкого спектра биохимических и физиологических процессов в организме относится церулоплазмин, механизмы влияния которого реализуются, в том числе и через его антиоксидантные свойства [8, 10, 11, 9].
Цель исследования – в условиях эксперимента определить эффективность влияния церулоплазмина (ЦП) относительно интенсивности СРО цельной крови и сыворотки при хронической физической нагрузке умеренной мощности.
Материалы и методы. Исследование проведено на белых беспородных крысах. Все эксперименты выполнены согласно Европейской Конвенции по защите экспериментальных животных. Хроническая физическая нагрузка умеренной мощности моделировалась ежедневным плаванием в течение 30 минут – 21 день. На 9, 15 и 21 день эксперимента, животные подвергались дополнительно физической нагрузке: плавали в течение 4-х минут с грузом массой 20 % от веса тела. Подобная экспериментальная модель аналогична тренировочному циклу подготовки спортсменов к соревновательному периоду. Забор крови производили на 9, 15, 21 сутки через 15–20 минут после нагрузки. Церулоплазмин вводился 3 раза (на 1, 4 и 7 сутки физической нагрузки) в суммарной дозе 60 мг/кг массы тела. Интенсивность СРО в цельной крови исследовали хемилюминесцентным методом в присутствии люминола на приборе «Хемилюминомер-003» с компьютерным обеспечением [12, 2]. Первоначально регистрировали базальную хемилюминесценцию (ХЛ) цельной крови: светосумму (СС) и максимальную светимость (МС). Далее в этих же пробах после инкубации регистрировали ХЛ - индуцированную. С учетом того, что основным источником свободных радикалов в цельной крови являются нейтрофилы, их активации (за счет адгезии к стеклянной поверхности) способствовала инкубация образцов крови (60 минут при 37 0С). Параллельно в крови подсчитывали общее количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу. ХЛ крови выражали в абсолютных величинах и с пересчетом на количество нейтрофилов (105/мл). Интенсивность пероксидации, как составляющей СРО, изучали методом железоиндуцированной хемилюминесценции сыворотки крови [12, 2]. Оценивали спонтанную и железоиндуцированную хемилюминесценцию (добавлением Fe2+ - 50 мкМ). Регистрацию хемилюминесценции сыворотки крови осуществляли на хемилюминомере ХЛ-003 с компьютерным обеспечением.
Продукты ПОЛ в крови оценивали спектрофотометрическим методом в изопропаноловой фракции с расчетом индексов окисления [3]. Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали в реакции восстановления нитросинего тетразолия [13]; активность каталазы определяли в цветной реакции с молибдатом аммония [7]; активность глютатион – редуктазы оценивали по способности окислять НАДН при длине волны 340 нм [1]; содержание церулоплазмина оценивали модифицированным методом Равина по способности окислять р-фенилендамин [5]. Общую антиокислительную активность (ОАО) оценивали фотометрическим тестом ImAnOx(TAS/TAC) Kit фирмы Immundiagnostik (Германия) по степени подавления оксидации в присутствии перекиси водорода. Статистическая обработка результатов исследования проводилась на персональном компьютере с помощью пакета программ анализа данных Statistica 6.0. Для оценки достоверности полученных результатов использовали непараметрический критерий Манна – Уитни.
Результаты исследования
ХФН умеренной мощности приводила к постепенному повышению базального свечения (СС и МС) в цельной крови относительно контроля. При этом индуцированное свечение цельной крови (СС и МС) было достоверно ниже контрольных значений (таблица 1). Основными источниками свободных радикалов в крови являются нейтрофилы, количество которых при физической нагрузке возрастает в 1,5 раза. При пересчете интенсивности базальной и индуцированной ХЛ крови на х105 нейтрофилов СС и МС достоверно снижаются (таблица 2). Показатели индуцированного свечения нейтрофилов к 21 суткам снижаются примерно в 3 раза. Таким образом, возрастание ХЛ цельной крови обусловлено увеличением в крови нейтрофильных лейкоцитов на фоне снижения их способности к продукции радикалов.
Введение ЦП при ХФН способствовало еще большему уменьшению продукции свободных радикалов нейтрофилами (15, 21 сутки); на 9–21 снижалась МС индуцированного свечения (таблица 2). Следствием этого было достижение нормальных величин базального свечения (СС и МС) в цельной крови, а СС и МС индуцированного свечения на 21 сутки приобретали самые низкие значения (таблица 1).
При физической нагрузке в сыворотке крови не изменялась спонтанная светимость (СПС), постепенно повышались: СС, амплитуда быстрой и медленной вспышки. ЦП не влиял на СПС, амплитуду медленной вспышки; на 21 сутки нормализовал амплитуду быстрой вспышки; повышал длительность латентного периода. В итоге под влиянием ЦП снижалась, но не нормализовалась светосумма свечения (таблица 3).
Таблица 1
Влияние ЦП на ХЛ цельной крови при физической нагрузке умеренной мощности (М±m)
|
Группы сравнения/ показатели
|
Контроль (n=9) |
ХФН умеренной мощности |
ХФН + ЦП |
|||||
|
9 сутки (n=8) |
15 сутки (n=8) |
21 сутки (n=9) |
9 сутки (n=8) |
15 сутки (n=8) |
21 сутки (n=9) |
|||
|
Базальное свечение |
СС, у.е.•мин |
0,677±0,02 |
0,80±0,05 |
0,95±0,04* |
0,97±0,05* |
0,65±0,059 |
0,71±0,03^ |
0,74±0,04^ |
|
МС, у.е. |
0,276±0,014 |
0,31±0,02 |
0,37±0,013* |
0,404±0,02* |
0,22±0,01*^ |
0,24±0,018^ |
0,27±0,016^ |
|
|
Индуциро-ванное свечение |
СС, у.е.•мин |
2,66±0,21 |
1,23±0,14* |
1,32±0,16* |
1,77±0,17* |
1,05±0,06* |
1,11±0,058* |
1,22±0,07*^ |
|
МС, у.е. |
0,79±0,14 |
0,475±0,04* |
0,49±0,037* |
0,578±0,06* |
0,33±0,017*^ |
0,36±0,023*^ |
0,41±0,019*^ |
|
* – достоверность (р≤0,05) относительно контроля; ^ – достоверность относительно аналогичного срока физической нагрузки.
Таблица 2
Влияние ЦП на ХЛ нейтрофилов (х105) при физической нагрузке умеренной мощности (М±m)
|
Группы сравнения/ показатели
|
Контроль (n=9) |
ХФН умеренной мощности |
ХФН + ЦП |
|||||
|
9 сутки (n=8) |
15 сутки (n=8) |
21 сутки (n=9) |
9 сутки (n=8) |
15 сутки (n=8) |
21 сутки (n=9) |
|||
|
Базальное свечение |
СС, у.е.•мин |
0,33±0,026 |
0,24±0,03* |
0,235±0,02* |
0,185±0,01* |
0,154±0,016* |
0,133±0,015*^ |
0,13±0,01*^ |
|
МС, у.е |
0,13±0,01 |
0,13±0,04 |
0,09±0,01* |
0,08±0,004* |
0,052±0,003* |
0,045±0,006*^ |
0,047±0,004*^ |
|
|
Индуцирован ное свечение |
СС, у.е.•мин |
1,29±0,13 |
0,35±0,02* |
0,34±0,07* |
0,31±0,03* |
0,248±0,015*^ |
0,20±0,017* |
0,21±0,02* |
|
МС, у.е |
0,39±0,08 |
0,13±0,01* |
0,135±0,025* |
0,11±0,01* |
0,078±0,004*^ |
0,066±0,008*^ |
0,07±0,006*^ |
|
* – достоверность (р≤0,05) относительно контроля; ^ – достоверность относительно аналогичного срока физической нагрузки.
Таблица 3
Влияние ЦП на ХЛ сыворотки крови при физической нагрузке умеренной мощности (М±m)
|
Группы сравнения/ показатели
|
Контроль (n=9) |
ХФН умеренной мощности |
ХФН+ЦП умеренной мощности |
||||
|
9 сутки (n=8) |
15 сутки (n=8) |
21 сутки (n=9) |
9 сутки (n=8) |
15 сутки (n=8) |
21 сутки (n=9) |
||
|
СС, у.е.•мин |
3,09±0,1 |
4,73±0,21* |
5,63±0,29* |
5,65±0,14* |
3,72±0,15*^ |
4,62±0,11*^ |
4,77±0,21*^ |
|
СПС, у.е.•мин |
0,22±0,06 |
0,15±0,05 |
0,14±0,06 |
0,23±0,07 |
0,14±0,05 |
0,14±0,05 |
0,14±0,06 |
|
Амплитуда быстрой вспышки, у.е. |
1,41±0,04 |
1,68±0,09 |
2,00±0,16 |
2,07±0,14* |
1,78±0,16 |
1,64±0,096 |
1,58±0,07^ |
|
Амплитуда медлен- ной вспышки, у.е |
1,65±0,05 |
2,67±0,13 |
3,02±0,15* |
3,04±0,06* |
2,24±0,1* 0,30 |
2,76±0,07* 0,22 |
2,91±0,09* 0,30 |
|
Длительность латентного периода, мм |
17,82±0,69 |
18,78±1,37
|
19,33±1,32 |
21,11±1,06 |
24±1,36* |
25,11±1,59*^ |
28,78±2,07*^ |
* – достоверность (р≤0,05) относительно контроля; ^ – достоверность относительно аналогичного срока физической нагрузки.
Таблица 4
Влияние ЦП на продукты ПОЛ в крови при физической нагрузке умеренной мощности (М±m)
|
Группы сравнения/ показатели
|
Контроль (n=10) |
ХФН умеренной мощности |
ХФН +ЦП |
||||
|
9 сутки (n=10) |
15 сутки (n=10) |
21 сутки (n=11) |
9 сутки (n=10) |
15 сутки (n=10) |
21 сутки (n=11) |
||
|
∑ =220 ед/мл |
2,99±0,21 |
4,01±0,31 |
4,10±0,14* |
4,43±0,24* |
3,41±0,17 |
3,54±0,27 |
3,59±0,17^ |
|
∑ =232 ед/мл |
1,28±0,095 |
1,96±0,16* |
1,80±0,09* |
2,17±0,08* |
1,78±0,17 |
1,77±0,09* |
1,55±0,14^ |
|
∑ =278 ед/мл |
0,80±0,06 |
1,125±0,10* |
1,22±0,12* |
1,34±0,09* |
0,95±0,11 |
1,00±0,11 |
1,03±0,13 |
|
∑ =400 ед/мл |
0,059±0,02 |
0,08±0,013 |
0,15±0,37 |
0,13±0,03 |
0,12±0,02 |
0,11±0,03 |
0,11±0,03 |
|
232/220 у.е.о |
0,43±0,02 |
0,52±0,07 |
0,45±0,04 |
0,50±0,036 |
0,53±0,04 |
0,53±0,05 |
0,45±0,056 |
|
278/220 у.е.о |
0,27±0,023 |
0,295±0,03 |
0,31±0,04 |
0,31±0,03 |
0,28±0,03 |
0,30±0,06 |
0,31±0,05 |
* – достоверность (р≤0,05) относительно контроля; ^ – достоверность относительно аналогичного срока физической нагрузки.
Таблица 5
Влияние ЦП на компоненты антиокислительной системы в крови при физической нагрузке умеренной интенсивности (М±m)
|
Показатели/ сроки |
Контроль (n=10) |
ХФН умеренной мощности |
ХФН +ЦП |
||||
|
9 сутки (n=10) |
15 сутки (n=10) |
21 сутки (n=11) |
9 сутки (n=15) |
15 сутки (n=11) |
21 сутки (n=14) |
||
|
СОД, ед/мл |
1,46±0,11 |
0,70±0,10* |
0,90±0,15* |
1,22±0,12 |
0,84±0,12* |
1,045±0,11 |
1,01±0,10* |
|
Каталаза мкат/л |
22,61±3,38 |
12,31±0,98* |
18,41±1,24 |
24,67±2,86 |
21,99±2,18^ |
23,67±1,54^ |
25,77±1,54 |
|
Глютатион-редуктаза МЕ |
8,04±0,32 |
11,69±0,71* |
14,04±1,14* |
13,92±1,31* |
11,22±0,805* |
13,17±0,88* |
15,84±0,65* |
|
ЦП мг/л |
333,95±22,87 |
439,32±18,27* |
451,09±24,01* |
481,23±23,71* |
450,92±15,75* |
455,65±15,04* |
475,59±19,62* |
|
ОАА мкмоль/л |
211,5±3,94 |
не смотрели |
не смотрели |
262,72±11,97* |
не смотрели |
не смотрели |
284,38±19,15* |
* – достоверность (р≤0,05) относительно контроля; ^ – достоверность относительно аналогичного срока физической нагрузки.
В крови при нагрузке возрастали общие, первичные и промежуточные продукты ПОЛ. За счет параллельного возрастания общих, первичных и промежуточных продуктов ПОЛ, их индексы окисления не изменялись. Под влиянием ЦП к 9 сутками произошла нормализация общих и промежуточных продуктов, к 21 суткам – первичных продуктов ПОЛ (таблица 4).
ХФН умеренной мощности влияла на состояние антиокислительной системы. В частности, к 9 суткам снижалась активность СОД и каталазы при восстановлении их активности к 21 суткам. Активность глютатион-редуктазы, содержание ЦП (9–21 сутки) были повышены. На 21 сутки была повышена общая антиокислительная активность (ОАА). Введение ЦП приводило лишь к нормализации активности каталазы (таблица 5).
Обсуждение
Итак, при ХФН умеренной мощности активируются свободнорадикальные процессы в цельной крови и ПОЛ в сыворотке. Это является следствием миогенного лейкоцитоза и нагрузочной гипоксии с дальнейшей реализацией компенсаторно-адаптивных процессов. Гипоксия инициирует образование активных форм кислорода с последующим развертыванием свободно-радикальных и перекисных реакций через умеренную мобилизацию эндогенных жирных кислот и стимуляцию симпатоадреналовой системы. Кислородные радикалы являются факторами формирования активированного состояния митохондрий. Кроме того, свободнорадикальные реакции обеспечивают поддержание интенсивного энергетического обмена и привлечения продуктов свободнорадикального окисления к метаболическим процессам. Основное действие ЦП при ХФН умеренной мощности проявилось на уровне нейтрофилов. Трехкратное введение ЦП приводило к снижению продукции свободных радикалов нейтрофильными лейкоцитами и ХЛ цельной крови. ЦП противостоял снижению активности каталазы, увеличивал длительность латентного периода, который в литературе рассматривается в качестве интегрального показателя мощности антиокислительной системы [4]. Восстановление активности каталазы под влиянием ЦП может быть связано с его дисмутирующей способностью. Указывается, что ЦП обладает СОД активностью [9, 4]. В плазме крови его действие аналогично действию клеточной СОД. Он восстанавливает О-2 с помощью пары Си2+ до Н2О, перехватывает свободные кислородные радикалы и предохраняет липидосодержащие структуры от их повреждающего действия [9]. ЦП в отличие от СОД не катализирует реакцию диспропорционирования, а взаимодействуют с предшественниками О2 радикалов. Восстановление активности каталазы под влиянием ЦП может быть связано с дополнительным разрушением О-2 и защитой каталазы от его инактивирующего влияния, при этом снижается вероятность восстановления трехвалентного железа и возможность образования ОН-, который служит прооксидантом ПОЛ [4]. Некоторые авторы считают ЦП антиоксидантом, который вызывает обрыв цепи свободных радикалов, перехватывает супероксидные радикалы, ингибирует аутоокисление липидов, не связывая эти эффекты с его ферроксидазной активностью [9]. Кроме того, ЦП может способствовать накоплению в клетках антиоксиданта глютатиона [15]. Все это может быть объяснением факта нормализации содержания общих, первичных и промежуточных продуктов ПОЛ и снижению железоиндуцированной ХЛ сыворотки крови под влиянием ЦП.
Выводы
- При ХФН умеренной мощности активируются свободнорадикальные процессы в цельной крови и ПОЛ в сыворотке; возрастает общая антиокислительная активность.
- Трехкратное введение ЦП в суммарной дозе 60 мг/кг массы тела приводило к снижению продукции свободных радикалов нейтрофильными лейкоцитами и ХЛ цельной крови.
- ЦП увеличивал длительность латентного периода, отражающего суммарную мощность антиокислительной системы, тем самым способствовал снижению железоиндуцированной ХЛ сыворотки крови и нормализации содержания общих, первичных, промежуточных продуктов ПОЛ.