Физическая нагрузка является одним из распространенных видов стрессорного воздействия на организм человека в повседневной жизни. Регулярная физическая нагрузка, как физиологический стресс, стимулирует функции и системы организма, обеспечивая за счет механизмов перекрестной адаптации его устойчивость к самым различным факторам окружающей среды [1]. В то же время выраженные физические нагрузки могут выступать в роли раздражителей, вызывающих реакцию дистресса, сопровождающуюся повреждением различных органов [4]. Показано, что система гемостаза является одной из наиболее реактивных систем организма, способной отвечать на действие различных по силе и продолжительности раздражителей эустрессорной и дистрессорной реакциями [7].
В зависимости от интенсивности и длительности физической нагрузки реакция системы гемостаза может быть адаптивной и дизадаптивной. Так, показано [7], что 30-минутная физическая нагрузка у экспериментальных животных сопровождается развитием совокупности гемостазиологических признаков, характерных для эустресса. В то же время 8-часовая нагрузка вызывает в системе гемостаза уже дизадаптивные реакции, проявляющиеся формированием состояния тромботической готовности.
Для того чтобы избежать развития этого состояния, необходимо повышать неспецифическую устойчивость и сопротивляемость организма к стрессорным воздействиям. Одним из возможных путей для достижения такого эффекта является использование адаптогенов. По мнению В. Н. Федорова с соавторами [6], «классическими» адаптогенами можно считать 4 препарата: женьшень, элеутерококк, дибазол и пантогематоген. Ранее показано, что предварительный курсовой прием элеутерококка эффективно устраняет признаки надвигающейся угрозы тромбообразования при выраженных однократных стрессорных воздействиях [8].
В настоящее время активно исследуется влияние продуктов пантового оленеводства на работоспособность и функциональное состояние организма. Уже выявлено, что пантогематоген обеспечивает более сбалансированную работу энергообеспечивающих механизмов организма, поддерживает стабильность липидного обмена, оказывает благоприятное действие на баланс в системе «прооксиданты – антиоксиданты», а также улучшает адаптационные процессы при интенсивной физической нагрузке [3]. При этом влияние пантогематогена на реакции системы гемостаза при выраженных однократных физических нагрузках изучено недостаточно. Также представляет интерес и выявление дозы пантогематогена, при которой возможно будут отмечаться наиболее положительные результаты со стороны системы гемостаза. Цель исследования: оценка возможности использования пантогематогена в качестве средства, устраняющего неблагоприятные гемостатические реакции при действии сверхпорогового стрессора.
Материал и методы исследования
Исследования были выполнены на 60 половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 192,5 [176,8-204,0]. Все животные были разделены на 5 групп: три опытные группы (n=3х10), одна контрольная (n=10) и группа интактных животных (n=20).
Три экспериментальные (опытные) группы животных в течение 30 дней принимали препарат «Пантогематоген (Лубяньгем)» (ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт пантового оленеводства» ФАНО России, г. Барнаул) по 3, 6 и 9 мл в сутки соответственно. Препарат, разведенный в суточном объеме воды, принимался экспериментальными животными перорально из индивидуальных поилок. По истечении 30-дневного цикла приёма адаптогена на 31 день животные подвергались однократной 8-часовой физической нагрузке в виде навязанного бега в тредбане со скоростью его вращения 6–8 м/мин.
Контрольная группа животных подвергалась аналогичной 8-часовой физической нагрузке после 30 дней приема воды в том же объеме, что и экспериментальные группы животных, но без добавления пантогематогена. Группа интактных животных не подвергалась физической нагрузке и курсовому приёму пантогематогена.
Кровь для исследования в объеме 5–6 мл получали путем забора из печеночного синуса в полистироловый шприц с широкой иглой, содержащий 0,11 М (3,8 %) раствор цитрата натрия (соотношение крови и цитрата 9:1), под эфирным наркозом непосредственно после окончания 8-часовой физической нагрузки. Использование крыс в экспериментах осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией и директивами по охране позвоночных животных, используемых в эксперименте [9].
Методы, позволяющие оценить состояние системы гемостаза, включали исследование тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза, уровня антикоагулянтов и фибринолитической активности [2]. В качестве реагентов для оценки системы гемостаза использовались диагностические наборы фирмы «Технология – Стандарт» (Россия) с использованием коагулометров «Минилаб» (Россия) и «Trombostat-2» (Германия). Подсчет количества тромбоцитов периферической крови и лейкоцитарной формулы проводился при помощи гематологического анализатора Drew3 – PAC (Великобритания). Индуцированную агрегацию тромбоцитов проводили на агрегометре «Биола», при этом в качестве индуктора использовался раствор АДФ концентрацией 10 мкг/мл.
Полученные в ходе исследования данные представлены в таблице в виде (m [25–75 %]), где m – медиана в выборочной совокупности; [25–75 %] – 25-й и 75-й перцентиль.
Достоверность различий оценивалась при помощи непараметрического U-критерия Манна – Уитни, так как не все признаки подчинялись нормальному распределению. Различия считались достоверными при уровне статистической значимости p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Данные исследования состояния системы гемостаза, зарегистрированные у интактных животных, а также контрольной и трех экспериментальных групп, представлены в таблице 1.
Таблица 1
Основные показатели системы гемостаза у интактных крыс, контрольной и экспериментальных групп животных (m [25–75 %])
|
Показатели |
Интактные животные (n=20) |
Однократная 8-часовая физическая нагрузка на 31 день |
|||
|
30 дней – Н2О |
30 дней - пантогематоген |
||||
|
Контрольная группа (n=9†) |
Опыт 1 (n=10, 3 мл/сут) |
Опыт 2 (n=10, 6 мл/сут) |
Опыт 3 (n=10, 9 мл/сут) |
||
|
Тромбоциты, 109/л |
569,5 [562,0-572,5] |
499,0 [404,0-594,0]
|
514,0 [494,0-537,0] ( Δ1 – 10 %) |
518,0 [508,0-596,0] |
560,0 [514,0-582,0] |
|
Индуцированная АДФ-агрегация тромбоцитов, макс. значение |
29,1 [28,6-29,8] |
3,2 [0,1-7,1] ( Δ1 – 89 %) |
15,3 [4,6-31,5]
|
31,4 [24,9-34,2] ( Δ2 + 881 %) |
29,1 [13,5-33,6] ( Δ2 + 809 %) |
|
Силиконовое время, с |
310,0 [298,0-321,0] |
260,0 [225,0-281,0] ( Δ1 – 16 %) |
245,0 [190,0-293,0]
|
318,0 [282,0-331,0] ( Δ2 + 22 %) |
260,0 [230,0-285,0] ( Δ1 – 16 %) |
|
АПТВ, с |
21,4 [20,6-22,3] |
17,2 [16,9-17,4] ( Δ1 – 20 %) |
18,0 [16,4-18,7] ( Δ1 – 16 %)
|
19,6 [18,7-20,8] ( Δ1 – 8 %) ( Δ2 + 8 %) |
20,3 [19,8-20,7] ( Δ2 + 18 %) |
|
Протромбиновое время, с |
26,2 [25,2-27,0] |
23,5 [20,6- 24,6] ( Δ1 – 10 %) |
23,1 [17,7-23,6] ( Δ1 – 12 %) |
24,9 [24,2-25,4] ( Δ2 + 6 %) |
25,6 [25,2-25,9] ( Δ2 + 9 %) |
|
Тромбиновое время, с |
44,9 [43,1-46,2] |
35,2 [33,1-39,5] ( Δ1 – 22 %)
|
45,5 [39,2-48,6] ( Δ2 + 29 %) |
42,5 [39,0-45,0] ( Δ2 + 21 %)
|
41,0 [38,5-41,1] ( Δ1 – 9 %) ( Δ2 + 16 %) |
|
РФМК, мг % |
3,5 [3,5-3,9] |
11,5 [11,5-12,5] ( Δ1 + 229 %)
|
6,5 [4,5-16,5] ( Δ1 + 86 %)
|
3,8 [3,5-4,9] ( Δ2 – 65 %)
|
5,5 [4,0-7,5] ( Δ1 + 57 %) ( Δ2 – 52 %) |
|
Содержание фибриногена, г/л |
2,2 [1,9-2,6] |
1,3 [1,1-1,5] ( Δ1 – 41 %) |
2,1 [1,7-2,1] ( Δ2 + 86 %) |
1,8 [1,8-2,1] ( Δ2 + 39 %) |
2,0 [1,9-2,2] ( Δ2 + 54 %) |
|
АТ III, % |
95,7 [94,7-97,3] |
57,8 [48,9-73,9] ( Δ1 – 40 %) |
67,0 [64,0-68,7] ( Δ1 – 30 %) |
93,8 [91,6-96,2] ( Δ2 + 62 %)
|
91,8 [90,6-93,7] ( Δ1 – 4 %) ( Δ2 + 59 %) |
|
Спонтанный эуглобулиновый фибринлиз, мин |
530,0 [506,3-560,0] |
742,5 [726,3-773,8 ( Δ1 + 40 %) |
630,0 [580,0-690,0] ( Δ1 + 19 %) ( Δ2 – 15 %) |
547,5 [533,8-565,0] ( Δ2 – 26 %) |
560,0 [541,3-575,0] ( Δ2 – 25 %) |
Примечания: РФМК – растворимые фибрин-мономерные комплексы; АПТВ – активированное парциальное тромбопластиновое время; АТ III – антитромбин III; † - из 10 крыс, подвергавшихся однократной 8-часовой физической нагрузке, 1 особь в ходе эксперимента погибла; Δ1 – статистически значимая разница экспериментальных и контрольной групп с интактными животными; Δ2 – статистически значимая разница экспериментальных групп с контрольной.
Отметим, что прирост массы тела экспериментальных животных за 30-дневный период приёма пантогематогена был больше, чем прирост массы тела у контрольной группы (таблица 2). Так, у группы, принимавшей по 3 мл пантогематогена в сутки – прирост массы тела составил на 137 % больше, чем прирост в контрольной группе; 6 мл в сутки – на 298 %, 9 мл в сутки – на 233 %. Возможно, это связано с качественным составом препарата, в составе которого выделяют большое количество аминокислот [5].
Таблица 2
Показатели массы тела до и после эксперимента, прирост массы тела у контрольной и экспериментальных групп за 30 дней эксперимента (m [25–75 %])
|
Показатели |
Контрольная группа (n=9) |
Опыт 1 (n=10, 3 мл/сут) |
Опыт 2 (n=10, 6 мл/сут) |
Опыт 3 (n=10, 9 мл/сут) |
|
Масса крыс до начала эксперимента, г |
208,5 [198,5-218,0] |
182,5 [171,8-196,5] |
184,5 [174,0-193,0] |
192,0 [176,5-198,8] |
|
Масса крыс на 30 день эксперимента, г |
234,0 [223,0-238,0] |
251,0 [245,0-254,0] |
279,5 [260,3-307,5] |
265,0 [253,5-288,0] |
|
Прирост массы тела крыс за время эксперимента, г |
25,5 [14,8-31,8] |
60,5 [56,0-82,0] ( Δ1 + 137 %) |
101,5 [81,8-125,3] ( Δ1 + 298 %) |
85,0 [70,3-95,3] ( Δ1 + 233 %) |
Примечания: Δ1 – статистически значимая разница прироста массы тела крыс экспериментальных групп с контрольной.
Первоначально было исследовано влияние однократной 8-часовой физической нагрузки на состояние системы гемостаза без предварительного приема пантогематогена (таблица 1, контрольная группа).
Как видно из таблицы, у контрольной группы животных 8-часовая физическая нагрузка вызывала со стороны сосудисто-тромбоцитарного гемостаза активацию агрегационной функции тромбоцитов на 89 % (p < 0,05) по сравнению с интактными животными. Плазменный гемостаз характеризовался активацией контактной фазы свертывания (силиконовое время), а также гиперкоагуляцией по внутреннему, внешнему пути (укорочение АПТВ и протромбинового времени) и на конечном этапе образования фибринового сгустка (тромбиновое время). Также, на 229 % (p < 0,05) повышалась концентрация растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) по сравнению с интактными крысами на фоне снижения на 41 % концентрации фибриногена, отмечалось угнетение антикоагулянтной активности плазмы (снижение АТ III) и снижение активности фибринолиза (удлинение времени спонтанного эуглобулинового сгустка). Эти лабораторные данные показывали, что у экспериментальных животных развивалось состояние тромботической готовности. Кроме того, во время эксперимента 10 % крыс погибло. Патоморфологическое обследование выявило отчетливые признаки прижизненного внутрисосудистого свертывания крови.
Известно, что лимфоцитопения, наравне с инволюцией тимуса и гипертрофией надпочечников, является универсальной реакцией организма на стресс [10]. Как видно из таблицы 3, у группы контрольных животных, подверженных 8-часовой физической нагрузке без предварительного приёма пантогематогена, в периферической крови отмечалось снижение абсолютного и относительного содержания лимфоцитов на 25 % и 9 % соответственно (p < 0,05). Таким образом, уменьшение количества лимфоцитов в периферической крови может служить ещё одним показателем развития дистресса у крыс после действия сверхпорогового раздражителя.
Таблица 3
Количество лейкоцитов, абсолютное и относительное содержание лимфоцитов в периферической крови интактных животных. Количество лейкоцитов, абсолютное и относительное содержание лимфоцитов в крови крыс экспериментальных и контрольной групп после 8-часовой физической нагрузки
|
Показатели |
Интактные животные (n=20) |
Однократная 8-часовая физическая нагрузка на 31 день |
|||
|
30 дней – Н2О |
30 дней - пантогематоген |
||||
|
Контрольная группа (n=9†) |
Опыт 1 (n=10, 3 мл/сут) |
Опыт 1 (n=10, 6 мл/сут) |
Опыт 1 (n=10, 9 мл/сут) |
||
|
WBC, 109/л |
14,9 [14,1-16,2] |
12,1 [9,5-14,3] ( Δ1 – 19 %) |
11,7 [11,1-12,8] |
14,3 [14,0-15,0]
|
14,6 [12,8-15,3]
|
|
Lym% |
93,7 [93,2-94,1] |
85,0 [84,4-85,5] ( Δ1 – 9 %) |
86,6 [85,5-89,3] ( Δ1 – 7 %) |
93,0 [91,1-94,0] ( Δ2 + 9 %) |
93,0 [92,2-94,6] ( Δ2 + 9 %) |
|
Lym#, 109/л |
13,8 [13,2-15,2] |
10,4 [8,1-12,1] ( Δ1 – 25 %) |
10,4 [9,5-11,1] ( Δ1 – 25 %) |
13,3 [12,9-13,6] ( Δ2 + 28 %) |
13,9 [11,7-14,2] ( Δ2 + 34 %) |
Примечания: WBC – количество лейкоцитов в абсолютных числах; Lym% – относительное содержание лимфоцитов; Lym# – количество лимфоцитов в абсолютных числах; Δ1 – статистически значимая разница показателей экспериментальных и контрольной групп с интактными животными; Δ2 – статистически значимая разница показателей экспериментальных групп с контрольной.
Предварительный курсовой прием пантогематогена в первой экспериментальной группе в дозировке 3 мл в сутки (Опыт 1) на уровне сосудисто-тромбоцитарного гемостаза не давал достоверно значимых различий как с контрольной группой, так и с показателями, зарегистрированными у интактных животных. Сохранялась значительная гиперкоагуляция по внутреннему и внешнему пути активации плазменного гемостаза, а также увеличивалась концентрация РФМК по сравнению с интактными животными. Антикоагулянтная активность плазмы и состояние фибринолиза были угнетены по сравнению с показателями интактных животных и приближались к значениям контрольной группы. Исходя из этого, можно утверждать, что предварительный 30-дневный курсовой прием пантогематогена в дозировке 3 мл в сутки не устранял риск развития у экспериментальных животных состояния тромботической готовности после 8-часовой физической нагрузки. Однако такие показатели, как тромбиновое время и концентрация фибриногена, приближались к значениям интактных животных, что свидетельствует о положительном, хоть и незначительном, влиянии такой дозировки пантогематогена на состояние системы гемостаза.
Абсолютное и относительное содержание лимфоцитов в периферической крови первой экспериментальной группы (Опыт 1) не отличались от показателей контрольной группы животных и характеризовались снижением этих показателей на 25 % и 7 % (p < 0,05) соответственно по сравнению с интактными животными. Всё это подтверждает, что предварительный приём пантогематогена в дозировке 3 мл в сутки не предотвращает развитие состояния дистресса у крыс после 8-часовой физической нагрузки.
Оценивая изменения в системе гемостаза у крыс, подвергавшихся аналогичной восьмичасовой физической нагрузке после предварительного курсового приёма пантогематогена в дозировке 6 и 9 мл в сутки (Опыт 2 и Опыт 3), можно отметить значительное уменьшение реактивности системы гемостаза на сверхпороговую физическую нагрузку по сравнению с контрольной группой животных. Это проявлялось в снижении в 9 раз активации агрегационной функции тромбоцитов по сравнению с контрольной группой и приближении значений этого показателя к показателям интактных животных. Время активации плазменного гемостаза по внешнему пути, концентрация фибриногена и уровень активности фибринолитической системы также достоверно не отличались от показателей, зарегистрированных у интактных животных. Внутренний путь и конечный этап активации гемостаза, концентрация РФМК и антикоагулянтная система отличались от показателей в контрольной группе. Так, АПТВ удлинялось на 8 % в Опыте 2 и на 18 % – в Опыте 3 (p < 0,05) по сравнению с контрольной группой, тромбиновое время удлинялось на 21 % и на 16 %, концентрация РФМК уменьшалась на 65 % и на 52 % (p < 0,05) соответственно, вплотную приближаясь к уровню интактных животных. Таким образом, предварительный прием пантогематогена в дозировках 6 и 9 мл в течение 30 дней значительно уменьшал риск тромбообразования после сверхпорогового стрессового воздействия. Абсолютное и относительное содержание лимфоцитов в периферической крови крыс у экспериментальных групп Опыт 2 и Опыт 3 достоверно не отличалось от показателей интактных животных. Совокупность полученных данных может служить косвенным признаком перехода состояния дистресс в эустресс после однократной 8-часовой физической нагрузки при увеличении дозировки предварительного приема пантогематогена от 3 мл до 6 и 9 мл в сутки.
При подробном рассмотрении результатов исследований в экспериментальных группах «Опыт 2» и «Опыт 3» можно найти различия. Так, время активации плазменного гемостаза по внутреннему пути у экспериментальной группы «Опыт 2» всё ещё отличалось от соответствующего показателя у интактных животных на 8 % (p < 0,05) в сторону гиперкоагуляции. У группы «Опыт 3» время конечного этапа свертывания отличалось от интактных животных на 9 % в сторону гиперкоагуляции, концентрация РФМК на 57 % превышала таковую у интактных крыс, антикоагулянтная активность плазмы была снижена на 4 %.
Заключение
Полученные результаты позволяют предположить, что предварительное применение пантогематогена, помимо обеспечения сбалансированной работы энергосберегающих механизмов организма, поддерживания стабильности липидного обмена, поддержания баланса в системе «прооксиданты — антиоксиданты», также позитивно влияет и на состояние системы гемостаза, снижая риск развития состояния тромботической готовности, которое развивается у крыс при воздействии однократного сверхпорогового стрессора.
Установлено, что наименьшие гемостазиологические сдвиги при стрессорном воздействии наблюдаются при предварительном 30-дневном курсовом приеме пантогематогена в дозировке 6 мл в сутки.
Данная работы выполнена на средства «Гранта Ректора АГМУ», при поддержке ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт пантового оленеводства» ФАНО России, г. Барнаул.