В условиях нашей страны среди зерновых колосовых культур самой высокой потенциальной продуктивностьюотличается озимая пшеница. По сравнению с яровыми формами зерновых, она полнее использует солнечную энергию, осенне-весеннюю влагу и питательные вещества почвы.
В условиях Сибириозимая пшеница используется слабо, так как недостаточно освоена агротехнология возделываниярайонированных зимостойких сортов. Отрицательное воздействие оказывают целый ряд природно-климатических факторов: резкие колебания температур деятельного слоя, низкая влажность воздуха в период активной вегетации, ливни, гради т.д.
Наряду с агротехникой и климатическими факторами гибель посевов могут вызыватьпатогены микробного и грибного происхождения. Ежегодные потери урожая пшеницы от различных фитопатогеновдостигают около 25% урожая [8].
В настоящее время против вредителей и болезней сельскохозяйственных культур в большинстве случаев применяются химические средства защиты растений. Следует отметить, что наряду с высокой эффективностью в подавлении численности вредных организмов, пестициды вызывают резистентность патогенов и появление видов не восприимчивых к химическим воздействиям.
Несмотря на это, химический метод, бесспорно, продолжает оставаться важнейшим средством оперативного сдерживания патогенов, однако ухудшение фитосанитарной обстановки и общей экологической ситуации в регионах России требуют новых подходов в развитии и использовании средств и способов биологической защиты.
Биологическая защита растений на современном этапе включает применение биопрепаратов на основе живых культур микроорганизмов.Известно, что микроорганизмы являются источником доступных для растений элементов минерального питания и способны выделять различные антибиотические вещества, защищающие растения от болезней и вредителей [4].
Эффективность биологических средств защиты во многом определяется выбором микроорганизмов, способных обеспечить защиту в течение вегетационного периода растения. Потенциальными биологическими агентами, перспективными для защиты растений от фитопатогенов, могут быть бактериальные штаммы, выделенные из многолетнемерзлых пород (ММП), отличающиеся устойчивостью к почвенно-климатическим условиям Севера.Большинство биопрепаратов на основе мезофильных штаммов бактерий малоэффективны в условиях низких температур, приходящихся на начало вегетации растений, когда они наиболее сильно подвержены воздействию фитопатогенных микроорганизмов. Использование бактерий выделенных из ММПможет стать альтернативой как широко используемым фунгицидам, так и биологическим препаратам предшествующего поколения.
Цель работы –определение эффективности предпосевной обработки семян озимой пшеницы бактериальными штаммами, выделенные из многолетнемерзлых пород Западной Сибири.
Материалы и методы
В качестве материала исследований были использованы семена озимой пшеницы сорта Тюменская-1 (2013г.), предоставленные научно-исследовательским институтом сельского хозяйства Северного Зауралья (ФГБНУ «НИИСХ Северного Зауралья»).
В качестве протравителя использовались бактериальные штаммы Bacillussimplex и Bacillusmegaterium, выделенные авторамииз мерзлых отложений Западной Сибири (Пуровский район). Эталонами для оценки эффективности применения бактериальных штаммов, в качестве протравителя,явились препараты биологического происхождения – «Фитоспорин-М» и химического – «РаксилУльтра». Оба препарата официально рекомендованы к применению на территории РФ против грибных и микробных фитопатогенов [2]. Бактериальные штаммы Bacillussimplex и Bacillusmegaterium выращивали на питательной среде следующего состава, (г/л): K2HPO4 – 1,0; MgSO4•7H2O – 0,5; (NH4)2SO4 – 2,0; пептон – 2,0; дрожжевой экстракт – 5,0; сахароза – 2,0. Культивирование осуществляли в колбах Эрленмейера на шейкере LOIP LS-120 со скорости вращения 140 об/мин, при температуре +25˚C и +5˚C в течение 50 ч и 72 ч соответственно. Оценку титра жизнеспособных клеток определяли методом Коха [10].
Варианты лабораторного опыта: 1. Контроль; 2. «Фитоспорин-М»; 3. «РаксилУльтра»; 4. Bacillussimplex (+25˚С); 5. Bacillus simplex (+5˚С); 6. Bacillus megaterium (+25˚С); 7. Bacillus megaterium (+5˚С); 8. Bacillus simplex + Bacillus megaterium (+25˚С); 9. Bacillussimplex + Bacillusmegaterium (+5˚С).
При проведении опыта, семена озимой пшеницы сорта Тюменская – 1 обрабатывали бактериальной суспензией с титром 108 – 109кл/мл и выдерживали в течение 2 ч при 22±2˚С. Обработку семян препаратами «Фитоспорин-М» и «РаксилУльтра» проводили согласно рекомендациям производителя. Контрольные семена замачивали в стерилизованной водопроводной воде.
Семенаозимой пшеницы проращивали в сосудах со стерилизованным песком, равномерно увлажненным раствором Кнопа, при температуре 22±2˚С и люминесцентном освещении (6 тыс. лк.) в режиме: 14 часов – свет, 10 часов – темнота. Сроки полива растений определялись визуально по состоянию субстрата. Каждый вариант опыта включал четыре повторности, по 50 семян. На 14 день вегетационного эксперимента растения извлекались из субстрата. С целью сохранения целостности корневой системы корни отделяли от субстрата, промывая водой. Из морфометрических показателей растений определялиследующие показатели: длину надземных и подземных частей, их массу и площадь первого листа. Содержание хлорофилловА+Ви внутриклеточных фенольных соединений в проростках пшеницы определяли спектрофотометрическим методом, содержание аскорбиновой кислоты определяли йодатным методом [9].
Математическую обработку опытных данных проводили с использованием программного средства для анализа и визуализации данных – R, версия 3.2.0 (FreeSoftwareFoundation, IncBoston, MA).
Результаты и обсуждение
Микроорганизмы,выделенные из ММП,в последнее десятилетие широко используются в различных отраслях промышленности.Одними из перспективных продуцентов биологически активных веществ являются бактерии, относящиеся к роду Bacillus. Это обусловлено высокой выживаемостью их во внешней среде, толерантностью к антропогенным воздействиям, технологичностью в производстве и применении.Продуцируемые этими бактериями биологически активные вещества подавляют рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
Для развития любого микроорганизма существуют определенные температурные и рН оптимумы, при которых обеспечивается максимальный рост, выход целевого продукта и т.д. Температурные границы для большинства видов родаBacillusдовольно широкие – от 4°до 43°С. Многие виды этого рода являются мезофилами и развиваются при 27–30°С [6]. По результатам изучения влияния температуры на особенности роста Bacillussimplex и Bacillusmegateriumбыл установлен оптимальный температурный диапазон роста: от +5до + 25˚C [3].
При фитопатологическом анализе пшеницы сорт Тюменская-1 доминировали представители рода Penicillium, Mucor,Alternariaи Fusarium,вызывающие плесневение семян.Результаты исследования лабораторной всхожести (Гост 12038-84) протравленных семян показали, что при обработке препаратом «Раксил Ультра» всхожесть по сравнению с контролем снижалась на 20%, а в остальных вариантах опыта оставалась на уровне контроля.
Результаты биометрических показателей проростков озимой пшеницы представлены в табл. 1.Максимальное статистически достоверное увеличение наблюдалось в длине подземной части растений после обработки семян бактериальными штаммами Bacillussimplex(p=0,04) и Bacillusmegaterium(p=0,01) при температуре культивирования +5˚С, а также после обработки семян штаммом Bacillusmegaterium(p=0,00) с температурой культивирования +25 ˚С. Масса надземной части проростков пшеницы повышалась только после инокуляции семян бактериальным штаммом Bacillussimplex +25 ˚С(p=0,00). Химический препарат «Раксил Ультра» снижал показатели длины и массы проростков пшеницы по отношению к контролю. Это объясняется тем, что входящее в состав препарата «Раксил Ультра» вещество тебуконазол способствует замедлению синтеза гиббереллинов и действует как регулятор роста, тем самым не допуская на начальной стадии онтогенезачрезмерного развития надземной части и способствует интенсивному развитию корневой системы. При обработке бактериальными штаммами и препаратом «Фитоспорин-М» статистически достоверных различий с контролем не выявлено.
Таблица 1
Влияние обработки препаратов «Раксил Ультра», «Фитоспорин-М» и перспективных бактериальных штаммов на биометрические показатели проростков озимой пшеницы
Обработка |
Длина надземной части, мм |
Длина подземной части, мм |
Масса надземной части, г |
Масса подземной части, г |
S листовой поверхности, см² |
Раксил-ультра |
|
|
|
|
|
Фитоспорин-М |
|
|
|
|
|
Bacillussimplex+5°C |
|
|
|
|
|
Bacillussimplex+25°C |
|
|
|
|
|
Bacillus megaterium+5°C |
|
|
|
|
|
Bacillus megaterium+25°C |
|
|
|
|
|
Bacillussimplex +megaterium+5°C |
|
|
|
|
|
Bacillussimplex +megaterium+25°C |
|
|
|
|
|
Примечание: над чертой – значение опытного варианта; под чертой –значение контрольного варианта.
По результатам проведенных исследований было установлено, что штаммы микроорганизмов, выделенных из ММП, могут избирательно влиять на рост и развитие растений, оказывая как стимулирующее, так и ингибирующее действие.
Известно, что площадь листовой поверхности растения позволяет оценить фотосинтетический потенциал и интенсивность его работы. Лист обладает наибольшими приспособительными качествами к условиям среды, что выражается в изменении площади ассимиляционной поверхности растения [1].Анализ проростков пшеницы показал, что общая площадь листовой поверхности в варианте с«Фитоспорин-М» и бактериальными штаммами из ММП не превышает уровняконтрольного варианта и статистически достоверно снижаетсяпри обработке препаратом «Раксил Ультра»(p=0,01), результаты представлены в табл.1.
Общее содержание хлорофилловA + B в двухнедельных проростках пшеницы количественно увеличивалось после обработки семян препаратом «Раксил Ультра» (рис. 1). Такой «озеленяющий эффект» растений после обработки препаратами химической природы вызван ингибированием этилена – гормона стресса. Растения продуцируют этилен в ответ на повреждение или в результате атаки патогенов. Сокращение выработки этилена может лимитировать природный ответ на стресс и визуально выражается в озеленяющем действии на растение.
Рис.1. Общее содержание хлорофиллов А+В в проростках озимой пшеницы сорта Тюменская-1:1. Контроль; 2. «Раксил Ультра»; 3. «Фитоспорин-М»; 4. Bacillussimplex +5°C; 5. Bacillussimplex +25°C; 6. Bacillusmegaterium +5°C; 7. Bacillus megaterium+25°C;
8. Bacillus simplex +Bacillus megaterium +5°C; 9.Bacillus simplex + Bacillus megaterium +25°C
Незначительноеповышение общего содержания хлорофиллов A + Bнаблюдалось после обработки бактериальными штаммами BacillussimplexиBacillussimplex+Bacillusmegateriumпри температуре культивирования +5 и +25˚С, а при обработке препаратом «Фитоспорин-М», наоборот, количественно снижалось по сравнению с контрольным вариантом.
В адаптации растений к изменениям условий окружающей среды важную роль отводят веществам фенольной природы, которые являются уникальными вторичными метаболитами. Они обладают широким биологическим действием, регулируют ряд внутриклеточных процессов, оказывают влияние на синтез белков и нуклеиновых кислот [5]. Количество фенольных соединений возрастает при повреждениях: механических, химических, биологических, например, грибами, бактериями или вирусами с возможным образованием новых фенольных соединений, таких какфитоалексиныи др. [11].
По результатам исследований выявлено, что количество внутриклеточных фенольных соединений в проросткахпшеницы повышается при воздействии всех исследуемых бактериальных штаммов, кроме Bacillussimplexс температурой культивирования+25˚C (рис.2). В подземной же части растений содержание фенолов увеличивается только при обработке штаммами BacillussimplexиBacillussimplex+Bacillusmegateriumс температурой культивирования+5˚С. Возможно, это объясняется тем, что при низких положительных температурах штамм Bacillussimplexвыделяет метаболиты, под влиянием которых происходит увеличение активности ферментов биосинтеза фенольных соединений. Кроме того, повышение содержания фенольных соединений в растительном организме свидетельствует о повышении их иммунитета. При воздействии препаратов «Раксил Ультра» и «Фитоспорин-М» в проростках пшеницы количество внутриклеточных фенольных соединений снижается.
Рис.2. Содержание внутриклеточных фенольных соединений в надземной и подземной части проростков озимой пшеницы сорта Тюменская-1: 1. Контроль; 2. «Раксил Ультра»; 3. «Фитоспорин-М»; 4. Bacillussimplex +5°C; 5. Bacillussimplex +25°C; 6. Bacillusmegaterium +5°C; 7. Bacillus megaterium+25°C; 8. Bacillus simplex + Bacillus megaterium +5°C; 9. Bacillussimplex +Bacillusmegaterium +25°C
Известна прямая связь между накоплением аскорбиновой кислоты и устойчивостью к действию неблагоприятных факторов среды. Исследователи отмечают, что в северных районах содержание витамина C в листьях, стеблях, корнях и плодах значительно больше, чем в растениях, возделываемых на юге. Например, в проростках гороха и пшеницы, культивируемых при температуре +6˚С, количество аскорбиновой кислоты значительно выше, чем в таких же проростках, выращенных при +25˚С. Накоплениевитамина связано с устойчивостью растений к холоду [7].
Анализ общего содержания аскорбиновой кислоты в проростках пшеницы показал, что содержание витамина Cувеличивалось при обработке семянбактериальными штаммами, в отличиеот препаратов «Раксил Ультра» и «Фитоспорин-М», которые снижали содержание аскорбиновой кислоты в побегах растений, по сравнению с контролем(рис.3).
Рис.3. Содержание аскорбиновой кислоты в надземной и подземной части проростков озимой пшеницы сорта Тюменская-1. 1. Контроль; 2. «Раксил Ультра»; 3. «Фитоспорин-М»; 4. Bacillussimplex +5°C; 5. Bacillussimplex +25°C; 6. Bacillusmegaterium+5°C; 7. Bacillus megaterium+25°C; 8. Bacillus simplex +Bacillus megaterium+5°C; 9. Bacillussimplex +Bacillusmegaterium+25°C
Заключение
Таким образом,выделенные из мерзлых отложений бактериальные штаммы не уступают, а в некоторых случаях превышают ростостимулирующую и биохимическую активность эталонных протравителей «Раксил Ультра»и «Фитоспорин-М». Отмечено, что предпосевная обработка бактериальными штаммами рода Bacillus в качестве протравителей была эффективна как при +5°C, так и при +25°C. Следовательно, выделенные микроорганизмы из ММПявляютсяперспективными агентами для применения в сельскохозяйственной практике в качестве основы для полифункционального биопрепарата.
Рецензенты:Мельников В.П., д.г.-м.н., председатель ТюмНЦ СО РАН, г.Тюмень;
Боме Н.А., д.с-х.н., профессор, заведующая кафедрой ботаники, биотехнологии и ландшафтной архитектуры, ФГБОУ ВО «Тюменский государственный университет» Минобрнауки России, г.Тюмень.