Первое десятилетие нового, XXI в. было объявлено ВОЗ Всемирной декадой костей и суставов. Это обусловлено постоянным увеличением числа больных среди населения ведущих стран мира, у которых регистрируются заболевания и травматические повреждения костно-суставного аппарата. В связи с увеличением случаев травматизма, количества посттравматических и постоперационных осложнений увеличилась и потребность в пластическом материале для замещения различных дефектов [10].
В хирургических и реанимационных отделениях клиник широко используются различные инвазивные материалы. Однако в настоящее время большую проблему представляют бактерии, способные колонизировать и формировать биопленки на медицинских имплантатах, катетерах, эндотрахеальных трубках и ином, абсолютно на любых поверхностях. Образование биопленок при этом ведет к возникновению тяжелых имплантатассоциированных инфекционных осложнений, сепсисов [1, 6, 7].
В Институте химии ДВО РАН были изготовлены специальные покрытия для имплантатов, сделанных из сплавов на основе титана и магния. В настоящее время титан и его сплавы являются наиболее распространенным материалом для изготовления костных имплантатов различного назначения. Это связано с его высокими антикоррозионными свойствами и биологической инертностью. По своей химической стойкости титан значительно превосходит другие традиционные материалы, используемые в имплантологии, такие как нержавеющая сталь, сплавы железа, никеля, хрома и кобальта. Важным фактором является также и то, что титан обладает наиболее близкими к костной ткани механическими свойствами [8]. В последнее время возрастает интерес исследователей к изучению сплавов на основе магния и их влияния на остеогенез [9]. Многочисленные эксперименты на лабораторных животных показали, что данные сплавы обладают хорошей биосовместимостью, достаточной коррозионной устойчивостью и имеют модуль упругости (модуль Юнга), который максимально приближен к модулю упругости кортикального слоя кости.
Для использования титановых и магниевых материалов с кальций - фосфатным покрытием в целях заместительных материалов при хирургических операциях необходимо провести научные исследования, позволяющие оценить их имплантационные свойства. В этой связи целесообразно использовать стерильные пластины, для чего следует подобрать условия стерилизации, способствующие сохранению поверхностных структур исследуемых покрытий, с целью дальнейшего их использования в постановке тестовых биологических и медицинских экспериментов. Главной задачей является обеспечение высокого уровня безопасности имплантатов: должна быть исключена возможность инфицирования бактериальными, грибковыми и вирусными инфекциями. Поэтому процесс изготовления любых биологических имплантатов должен сопровождаться надежной стерилизацией с сохранением пластических свойств материалов.
Цель данного исследования - подобрать щадящие способы стерилизации поверхности титановых и магниевых имплантационных материалов с кальций-фосфатным покрытием, обеспечивающие сохранение пластических свойств материалов.
Материал и методы исследования
В качестве материала, на который наносилось покрытие, использовался технически чистый титан марки ВТ1-0 (Fe 0,25%; Si 0,12%; С 0,07%; О 0,12%; N 0,04%; Н 0,01%, остальное Ti). Перед оксидированием образцы в виде плоских металлических пластин размером 8 мм × 8 мм × 2 мм механически обрабатывали до определенного уровня шероховатости (Ra = 0,12 мкм), выравнивая поверхность, освобождая ее от различных дефектов, промывали в дистиллированной воде и обезжиривали спиртом (образец 1 ТБП). Плазменное электролитическое оксидирование проводили в биполярном режиме [2, 5] в электролите, содержащем 30 г/л глицерофосфата кальция (C3H7O6P)Ca·2H2O и 40 г/л ацетата кальция Ca(CH3COOO)2·H2O (образец 2 ТПП). Согласно данным рентгенофазового анализа в состав покрытия входит гидроксиапатит Ca10(PO4)6(OH)2.
Для запечатывания пор ПЭО-слоя и создания композиционного полимерсодежащего покрытия использовали ультрадисперсный политетрафторэтилен (УПТФЭ, торговая марка Форум®), полученный методом термоградиентного синтеза (метод разработан в лаборатории фторидных материалов Института химии ДВО РАН). Нанесение полимера на ПЭО-покрытие осуществляли двумя способами. При использовании первого - образцы на 10-15 с погружали в суспензию на основе изопропилового спирта, содержащую частицы УПТФЭ размером 0,2-0,6 мкм (100-150 г/л) и смачиватель ОП-10 (6,0-8,0 г/л). После полного испарения изопропилового спирта с поверхности образец подвергали термической обработке при 200-250°С в течение 3 мин (образец 3 ТПУ). Во втором случае нанесение полимера осуществлялось электрофоретическим методом с последующей термообработкой композиционного покрытия в муфельной печи при 315°С в течение 15 мин (образец 4 ТПЭ). Концентрация частиц в используемой суспензии составляла 20 г/л. Напряжение электрофоретического осаждения частиц полимера на ПЭО-слой поддерживалось потенциостатически при значении 200 В.
Для подбора методов стерилизации магниевых образцов использовали аналогичного размера пластины из сплава магния МА8 (Mg-Mn-Ce). Состав сплава следующий (масс. %): 1,5-2,5 Mn, 0,15-0,35 Ce, остальное Mg. Плазменное электролитическое оксидирование проводили в электролите, содержащем 25 г/л глицерофосфата кальция (C3H7O6P)Ca·2H2O и 5 г/л фторида натрия (NaF). Раствор готовили путем смешивания компонентов при тщательном перемешивании. Затем путем добавления 20%-ного раствора NaOH pH электролита доводили до значений 10,9-11,3. Оксидирование проводили в гальваностатическом режиме с плотностью тока j = 0,67 А/см2 в течение t = 300 с, при этом конечное напряжение на аноде достигало 540 B. В качестве источника тока использовали реверсивный тиристорный агрегат. Частота поляризующих импульсов составляла 300 Гц. Контроль электрических параметров осуществляли через автоматизированную систему управления и контроля, сопряженную с компьютером, оснащенным соответствующим программным обеспечением.
Для создания композиционного полимерсодержащего покрытия на магниевом сплаве МА8 использовали вышеприведенную методику для образцов на титане ВТ1-0: МА8 с кальций-фосфатным ПЭО-покрытием, обработанный УПТФЭ методом окунания (образец 5 MgПУ), МА8 с кальций-фосфатным ПЭО-покрытием, обработанный УПТФЭ методом электрофоретического осаждения (образец 6 MgПЭ), МА8 с кальций-фосфатным ПЭО-покрытием, полученным в силикатно-фторидном электролите [3, 4], обработанный УПТФЭ методом электрофоретического осаждения (образец 7 MgSiЭ). Данные образцы были получены в Институте химии ДВО РАН и предоставлены для исследования.
Принятые в микробиологической практике стерилизация сухим жаром (160°С в течение 2 ч) и автоклавирование (стерилизация текучим паром при 121°С под высоким давлением 1,2-1,5 атм) были опробованы и исключены, так как приводили к значительной деформации пластин и видимому нарушению их поверхностного слоя. Для стерилизации дисков были использованы следующие методы ввиду их доступности, щадящего действия на поверхность и обеспечения гибели в стерилизуемом материале вегетативных и споровых форм патогенных и непатогенных микроорганизмов:
- тиндализация, или метод дробной стерилизации при низких температурах, - последовательное прогревание сред при температуре 60°С (первый день) и 80°С (второй день) в течение 40 мин метод позволяет уничтожать не только вегетирующие клетки (погибают в течение нескольких минут), но и споры микроорганизмов. Такие воздействия разрушают структуру большинства органических соединений и ведут к значительному испарению жидкостей (например, воды из питательных сред);
- обработка 70%-ным раствором этилового спирта в течение 20 мин;
- обеззараживание ультрафиолетовым излучением в течение 30 мин на расстоянии 45-50 см от источника излучения (максимально возможное расстояние при обработке в ламинаре);
- обработка 70%-ным раствором этилового спирта в течение 20 мин и обеззараживание ультрафиолетовым излучением в течение 30 мин на расстоянии 45-50 см.
После стерилизации указанными способами были сделаны посевы методом отпечатка пластин на чашки Петри с питательным агаром. Контролем послужили диски, не подвергавшиеся стерилизации.
Результаты исследования и их обсуждение
В результате проведенных исследований были получены результаты, представленные в таблице 1. Исходно обсемененность необработанных пластин микроорганизмами была выше по сравнению с обработанными.
Таблица 1
Обсемененность титановых и магниевых пластин после стерилизации разными способами (количество выросших колоний)
|
тип образцов |
контроль |
методы стерилизации |
||||
|
60°С 40 мин (первые сутки) |
80°С 40 мин (вторые сутки) |
спирт 70% (20 мин) |
УФ-излучение (30 мин), 45-50 см от источника |
спирт 70% (20 мин) + УФ-излучение (30 мин), 45-50 см от источника |
||
|
TБП обр. 1 |
54±6 |
8±2 |
25±2 |
4±1 |
3±1 |
0 |
|
TПП обр. 2 |
1±0 |
7±1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
TПЭ обр. 4 |
20±5 |
9±1 |
0 |
15±2 |
0 |
0 |
|
TПУ обр. 3 |
9±1 |
7±2 |
10±2 |
3 ±1 |
0 |
0 |
|
MgSiЭ обр. 7 |
1±0 |
5± 1 |
0 |
0 |
2±0 |
0 |
|
MgПЭ обр. 6 |
2±0 |
5±1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
MgПУ обр. 5 |
8±3 |
11±2 |
0 |
0 |
2±0 |
0 |
Можно отметить, что титановые пластины с электролитическим оксидированием и промытые в дистиллированной воде (ТПП), а также с ПЭО-покрытием и обработанные электрофорезом (ТПЭ) лучше поддавались предложенным методам стерилизации, чем необработанные титановые пластины. Однако тиндализация не была в данном случае эффективной. В результате такого дробного прогрева погибают вегетативные клетки бактерий, проросшие из термостойких спор. Основной недостаток - невозможность полной элиминации микроорганизмов, так как некоторые споры не успевают прорастать во временных интервалах между сеансами прогревания, а некоторые вегетативные клетки успевают образовать термостабильные споры. Малое количество колоний на чашке в контроле и большое количество после воздействия температурой 600 С говорит о том, что на поверхности дисков отсутствовали вегетативные клетки микроорганизмов, а присутствовали споровые формы, которые после действия температурой 800С проросли, возвратившись к состоянию вегетативной клетки. В результате обработки высокой температурой поверхности магниевых пластин становились более пористыми по сравнению с контролем.
Спиртовая обработка не была эффективной в случае титановых пластин. Более длительное пребывание в спиртовом растворе приводило к видимым изменениям на поверхности пластин, как магниевых, так и титановых.
Обработка УФ не была эффективной в случае использования пластин с магниевым покрытием. Если облучение проводили на более коротком расстоянии, наблюдали изменения на поверхности исследуемых пластин.
Вариантом, когда все виды пластин после стерилизации оказались стерильными, было сочетанное использование спиртовой обработки в течение 20 мин с последующим подсушиванием под УФ-лампой в течение 30 мин на расстоянии 45-50 см от источника излучения.
Заключение
Обработка температурой последовательно (60 и 80°С) с экспозицией 40 мин была эффективна для всех типов образцов, кроме титановых без покрытия (ТБП) и ТПУ. Однако воздействие температурой на магниевые пластины приводило к деформации их поверхности, что проявлялось в увеличении пористости материала по сравнению с контролем. Обработка 70%-ным этиловым спиртом в течение 20 мин была эффективна только для магниевых образцов и ТПП. Воздействие на исследуемые материалы ультрафиолетом показано, что наиболее уязвимыми в этом отношении являются пластины из сплавов магния. УФ-излучение не давало необходимого результата, а при уменьшении расстояния от бактерицидной лампы происходила визуальная деформация поверхности магниевых пластин. По итогам проведенных исследований самым эффективным методом стерилизации, обеззараживающим поверхности и сохраняющим структуру образцов всех типов изучаемых материалов, оказалась обработка 70%-ным раствором спирта в течение 20 мин в сочетании с 30-минутным облучением ультрафиолетом на расстоянии 45-50 см от бактерицидной лампы.
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (№ 14-33-00009) и Правительства РФ (Федерального агентства научных организаций).
Рецензенты:
Мартынова А.В., д.м.н., профессор каф. биохимии, микробиологии и биотехнологии ФГАОУ ВПО «Дальневосточный федеральный университет», г. Владивосток;
Кузнецова Татьяна Алексеевна, д.б.н., зав. лабораторией иммунологии ФГБУ НИИЭМ им. Г.П. Сомова, СО РАМН, г. Владивосток.