Клеточная пролиферация – один из основных биологических процессов, обеспечивающих функционирование органов и тканей и лежащих в основе их неопластической трансформации [3,7]. Универсальным маркером для оценки клеточного цикла является ядерный белок – антиген Ki-67 (клон MIB-1), по экспрессии которого можно исследовать пролиферативную активность клеток [4]. Антитела к Ki-67 выявляют пролиферирующие клетки, находящиеся в разных фазах цикла. Это наиболее надежный и четкий маркер пролиферации, который используется как важный прогностический критерий пролиферативной активности клеток [5,8].
Антиген Ki-67, выявляемый соответствующими моноклональными антителами, представляет собой короткоживущий протеин, разрушающийся в течение 1,5-2 часов. Поэтому, антитела к Ki-67 выявляют только делящиеся клетки, т.к. Ki-67 не успевает накапливаться и не остается в покоящихся клетках [6,9].
Экспрессия данного белка неодинакова в клетках паравазальной соединительной ткани разных органов на различных этапах онтогенеза.
Целью исследования стало исследование активности процессов пролиферации фибробластов в паравазальной соединительной ткани сердца, желудка и подвздошной кишки в возрастном аспекте.
Материал и методы исследования
Для проведения исследования производился забор препаратов сердца, желудка и подвздошной кишки от 30 трупов мужчин трех возрастных групп (первый период зрелого возраста (n=10), пожилой возраст (n=10) и старческий возраст (n=10)), умерших от ненасильственной смерти с быстрым темпом умирания, от причин, не связанных с заболеваниями исследуемых органов. Забор органов производился не позднее 24 часов после констатации факта смерти.
Определение экспрессии Ki-67 в клетках паравазальной соединительной ткани проводилось по иммуногистохимической методике с использованием мышиных антител (DAKO) в разведении 1:75. Визуализирующая система – DAKO REAL Detection System Peroxidase/DAB+ Rabbit/Mouse (DAKO, Дания). Исследование проводилось в строгом соответствии со стандартным протоколом фирмы производителя антител (DAKO, Дания).
При микроскопии (х400, микроскоп «Биолам»-АУ12) регистрировались клетки осуществляющие экспрессию белка Ki-67 (клон MIB-1). Подсчет количества Ki-67-позитивных клеток производился на 100-300 клеток при анализе не менее 10 полей зрения.
В результате проводилось определение индекса пролиферации (ИП) по формуле:
количество Ki-67+ клеток
ИП = ------------------------------------- × 100%
общее количество клеток
С целью выявления адекватной работы системы визуализации, специфичности положительного окрашивания и для проверки соблюдения методической последовательности использовались положительные и отрицательные контроли. Для определения корректной работы антител исследовались положительные контроли, в которых окрашивалась ткань, заведомо содержащая исследуемые антигены. Для отрицательного контроля использовались срезы тканей изучаемых органов, в которых при проведении ИГХ реакции была исключена инкубация с первичными антителами, на них наносился только дилюент [1].
Все проведенные исследования выполнены с соблюдением этических принципов (протокол №24/2010 заседания локального этического комитета ГОУ ВПО «КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» от 14.05.2010г.)
Все полученные количественные данные подвергались необходимой статистической обработке с помощью компьютерной программы «Statistica 6.0 for Windows». Статистический анализ включал в себя методы описательной статистики. Учитывая малый объем выборки (n=30), для оценки межгрупповых различий распределения относительных долей ИП применяли непараметрический критерий хи-квадрат (χ²). После расчета данного критерия по стандартным таблицам находили критическое значение χ² с учетом количества степеней свободы, отдельно для каждой группы сравниваемых признаков. Если полученное эмпирическое значение χ² было больше критического – различия признавали статистически значимыми [2].
Результаты исследования и их обсуждение
В результате проведенного исследования установлено, что в первом периоде зрелого возраста в клетках паравазальной соединительной ткани уровень пролиферации достаточно высокий и примерно одинаков для всех изученных органов.
Исключением из этой общей тенденции является паравазальная соединительная ткань сердца, в которой ИП в данной возрастной группе достоверно наименьший и составляет 33,60%±0,78 (χ2=8,91) (таблица 1, рис. 1).
Таблица 1
Количество Ki-67–позитивных клеток в структуре паравазальной соединительной ткани полых органов, %
|
Возраст
Орган |
Первый период зрелого возраста |
Пожилой возраст |
Старческий возраст |
|
1 |
2 |
3 |
|
|
Сердце (n=10) |
33,60±0,78 |
23,89±1,71 |
19,90±1,36 |
|
χ2 1-2 = 3,47; χ2 1-3 = 7,16 (Р<0,01); χ2 2-3 = 0,71 |
|||
|
Желудок (n=10) |
43,26±0,48 |
22,78±0,38 |
20,50±0,79 |
|
χ2 1-2 = 14,06 (Р<0,01); χ2 1-3 = 19,14 (Р<0,01); χ2 2-3 = 0,34 |
|||
|
Подвздошная кишка (n=10) |
43,78±0,93 |
23,50±0,70 |
20,24±0,73 |
|
χ2 1-2 = 15,31(Р<0,01; χ2 1-3 = 21,15 (Р<0,01); χ2 2-3 = 0,54 |
|||
Рис. 1. Кi-67–позитивные клетки паравазальной соединительной ткани сердца
мужчины 30 лет (× 400)
С возрастом установлено постепенное снижение количества клеток, осуществляющих экспрессию белка Ki-67, и, как следствие, находящихся в состоянии пролиферации. При этом, паравазальная соединительная ткань всех исследуемых органов характеризуется практически одинаковым процентным содержанием Ki-67–позитивных клеток в возрасте старше 60 лет (таблица 1).
В старческом возрасте описанная тенденция сохраняется: количество Ki-67–позитивных клеток продолжает уменьшается (таблица 1). При этом достоверной разницы данного показателя между исследуемыми полыми органами не установлено.
Характерной чертой пролиферативной активности фибробластов паравазальной соединительной ткани полых органов является достаточно большое количество Ki-67–позитивных клеток даже в возрасте старше 75 лет (таблица 1, рис. 2).
Рис. 2. Кi-67–позитивные клетки в паравазальной соединительной ткани стенки подвздошной кишки мужчины 88 лет (× 400)
Таким образом, проведенное исследование позволило установить уровень пролиферативной активности клеток соединительной ткани в возрастном аспекте. Выявлено, что в первом периоде зрелого возраста паравазальная соединительная ткань всех изучаемых органов характеризуется достаточно высоким ИП, что может свидетельствовать о больших потенциальных возможностях клеток и, следовательно, может сказываться на функциональной активности кровеносных сосудов.
Исследование показало, что в старших возрастных группах количество клеток, осуществляющих экспрессию белка Ki-67, снижается. В то же самое время выявлено, что полые органы даже после 75 летнего возраста сохраняют высокий ИП, что создает условия, в данной возрастной группе, для увеличения риска возникновения клеточных линий, имеющих мутации генов.
Заключение
Проведенное исследование позволило установить особенности пролиферативной активности клеток фибробластов паравазальной соединительной ткани сердца, желудка и подвздошной кишки мужчин в трех возрастной группах. Все полученные в результате проведенного исследования данные по определению процентного содержания Ki-67–позитивных клеток в структуре паравазальной соединительной ткани подтверждают и полностью вписываются в общие закономерности возрастной изменчивости соединительной ткани организма человека.
Рецензенты:Горбунов Н.С., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой оперативной хирургии и топографической анатомии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, г. Красноярск;
Синдеева Л.В., д.м.н., доцент кафедры анатомии и гистологии человека ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, г. Красноярск.