Цель. Целью исследования явилось изучение динамики свободнорадикальных процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазме крови: конечного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) и промежуточных продуктов ПОЛ (ацетилгидроперекисей диеновых конъюгатов, кетодиенов, сопряженных триенов) и в тканях головного мозга - МДА при стрессогенном воздействии и при фармакологической коррекции (введение α-токоферол-ацетата, циклоферона) у половозрелых крыс.
α-Токоферол является природным антиоксидантом, способен разрушать активные метаболиты кислорода, участвует в защите липопротеинов сыворотки крови, стабилизирует структуру цитолеммы, связывает продукты гидролиза фосфолипидов, на генном уровне осуществляет коррекцию апоптоза [4].
Согласно современным данным, циклоферон обуславливает стимуляцию выработки эндогенного интерферона, влияет на продукцию других цитокинов (фактор некроза опухоли, интерлейкины), модулирует уровень программмированной клеточной гибели [8].
Материалы и методы
В эксперименте было использовано 64 белых беспородных старых крыс-самцов (30 мес), средней массой 352 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария при естественном световом освещении и свободном доступе к воде и пище.
В опыте использованы следующие группы.
1. Интактные крысы (контроль) (n = 8).
2. Крысы, получавшие масляный 10%-ный раствор α-токоферол-ацетата per os, в течение двух недель, в дозе 0,5 мг на 100 г массы тела (n = 8).
3. Крысы, получавшие циклоферон (Полисан СПб) per os, в течение двух недель, 1,19 мг на 100 г массы тела (n = 8).
4. Крысы, получавшие совместно 10%-ный масляный раствор α-токоферол-ацетата (0,5 мг на 100 г) и циклоферон per os (1,19 мг на 100 г массы тела) в течение двух недель (n = 8).
5. Крысы, подвергшиеся иммобилизационному стрессу в пластиковых цилиндрах по 1 часу в день в течение двух недель (n = 8).
6. Стрессированные крысы, получавшие предварительно 10%-ный масляный раствор α-токоферол-ацетата в тех же дозах в течение двух недель (n = 8).
7. Стрессированные крысы, получавшие предварительно циклоферон в тех же дозах в течение двух недель (n = 8).
8. Стрессированные крысы, получавшие предварительно раствор α-токоферол-ацетата и циклоферон тех же дозах в течение двух недель (n = 8).
По окончании воздействий на следующий день проводили декапитацию животных.
Определение динамики процессов ПОЛ в гомогенатах тканей головного мозга (по методу И.Д. Стальной и Т.Г. Гаришвили (1977) в модификации Е.А. Строева и В.Г. Макаровой (1986) [3].
Метод основан на реакции одного из конечных продуктов - малонового диальдегида (МДА) - с тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при 532 нм.
Экстинкцию всех проб измеряли на спектрофотометре (светофильтр зеленый, длина волны 532 нм) в кювете с толщиной слоя 1 см.
Единицы измерения в методике определения скорости ПОЛ - нмоль/час, для определения уровня МДА - нмоль/500 мг ткани.
Определение уровня свободнорадикального окисления липидов в плазме крови
Для оценки уровня ПОЛ у животных контрольной и опытных групп определяли исходную концентрацию вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида в плазме крови тиобарбитуровым методом [2; 3].
Высчитывали среднюю величину содержания ТБК - активных продуктов на одного животного и далее на группу.
Определение уровня промежуточных продуктов перекисного окисления липидов (ПП ПОЛ)
(по методу Волчегорского В.А. и соавторов (1989)) [1].
Интенсивность образования промежуточных продуктов ПОЛ с изолированными двойными связями (220 нм), диеновых коньюгатов (232 нм), кетодиенов и сопряженных триенов (278 нм) спектрофотометрически определяли в изопропанольной и гептановой фракции.
Принцип метода основан на интенсивном поглощении конъюгированных диеновых структур в области 232-234 нм.
Полученные экспериментальные данные обработаны с использованием пакета статистических программ Microsoft Excel. Сравнение средних показателей производили с помощью стандартных методов вариационной статистики. Различия в показателях считались статистически значимыми при уровне р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Исследование процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в гомогенатах тканей головного мозга показало (табл. 1), что при введении α-токоферол-ацетата скорость спонтанного ПОЛ снижается на 11,8%, количество МДА уменьшается на 25,6% по сравнению с контрольной группой. При введении циклоферона также наблюдается снижение скорости спонтанного ПОЛ на 13,9%, количество МДА на 20,3%.
Таблица 1
Показатели динамики процессов ПОЛ в гомогенатах тканей головного мозга
|
|
Скорость спонт. ПОЛ нмоль/ч |
Скорость АСК-ПОЛ нмоль/ч |
Количество МДА нмоль/500 мг ткани |
|
|
1 |
Контроль |
11,17+/- 0,3 |
88,41 +/- 1,8 |
1,68+/-0,12 |
|
2 |
Токоферол |
9,88 +/- 0,4*** |
79,17 +/- 1,9*** |
1,25 +/- 0,1*** |
|
3 |
Циклоферон |
9,62 +/- 0,4*** |
82,27 +/- 2,4** |
1,34 +/- 0,09** |
|
4 |
Токоферол + Циклоферон |
8,43 +/- 0,6*** |
76,84+/- 2,6*** |
1,22 +/- 0,11*** |
|
5 |
Стресс |
13,61 +/- 0,76*** |
99,81 +/- 2,1*** |
2,45 +/- 0,24*** |
|
6 |
Стресс + Токоферол |
10,65+/- 0,5*000 |
81,87+/-1,9**000 |
1,52 +/- 0,10*000 |
|
7 |
Стресс + Циклоферон |
8,95+/-0,82***000 |
76,22+/-2,3***000 |
1,54 +/- 0,09*000 |
|
8 |
Стресс + Токоферол + Циклоферон |
8,21+/-0,57***000 |
74,08+/-2,2***000 |
1,49 +/- 0,10*000 |
Примечание. Статистическая значимость с группой «Контроль»: * - p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001.
Статистическая значимость с группой «Стресс»: 0-p < 0,05; 00 -p < 0,01; 000 - p < 0,001.
При комбинированном воздействии α-токоферол-ацетата с циклофероном скорость спонтанного ПОЛ снизилась на 24,5%, скорость АСК-зависимого ПОЛ - на 13,2% и количество МДА - на 27,4%, что отразило большую активность совместного действия препаратов. Иммобилизационный стресс старых животных привел к увеличению показателей ПОЛ: скорость спонтанного ПОЛ увеличилась на 22,0%, скорость АСК-зависимого ПОЛ на 13,1%, а также значительно повысилось количество МДА - на 45,8% по сравнению с контролем. Действие α -токоферол-ацетата у стрессированной группы вызвало снижение скорости спонтанного ПОЛ на 21,7%, АСК-зависимого ПОЛ на 18,1%, количества МДА на 28,6%. Отмечена динамика снижения показателей при введении циклоферона у стрессированных животных: скорость спонтанного ПОЛ - на 20,4%, АСК-зависимого ПОЛ - на 26,4%, количества МДА на 38,3% - по сравнению с интактными стрессированными животными. Циклоферон на стрессированных животных повлиял следующим образом: скорость спонтанного ПОЛ снизилась на 34,6%, АСК-зависимого ПОЛ - на 23,6% и МДА - на 37,2%, по сравнению со стрессированной группой.
Введение комплекса α-токоферол-ацетата и циклоферона стрессированным старым крысам снизило скорость спонтанного ПОЛ на 34,2%, АСК-зависимого ПОЛ (26,1%) и количество МДА (39,2%) по сравнению с интактной стрессированной группой, а также привело к снижению показателей по сравнению с контрольной группой, находящейся в покое: скорость спонтанного ПОЛ снизилась на 20,1%, АСК-ПОЛ - на 15,3%, количество МДА - на 11,3%.
Изменение концентрации МДА в плазме крови
При определении количества малонового диальдегида было выявлено изменение содержания липидных перекисей в плазме крови у экспериментальных 30-месячных крыс (табл. 2).
Таблица 2
Показатели конечного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) в плазме крови старых крыс
|
|
Группы животных |
Количество МДА, мкмоль/л |
|
1 |
Контроль |
1,94 +/- 0,12 |
|
2 |
Токоферол |
1,43 +/- 0,08*** |
|
3 |
Циклоферон |
1,43 +/- 0,09*** |
|
4 |
Токоферол + Циклоферон |
1,44 +/- 0,06*** |
|
5 |
Стресс |
3,79 +/- 0,1*** |
|
6 |
Стресс + Токоферол |
1,64+/- 0,09*000 |
|
7 |
Стресс + Циклоферон |
1,53 +/- 0,14*000 |
|
8 |
Стресс + Токоферол + Циклоферон |
1,61+/- 0,12*000 |
Примечание. Статистическая значимость с группой «Контроль»: * - p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001.
Статистическая значимость с группой «Стресс»: 0-p < 0,05; 00 -p < 0,01; 000 - p < 0,001.
Действие α-токоферола на контрольную группу крыс, находящихся в покое, привело к снижению концентрации МДА в плазме на 26,3% по сравнению с контрольной группой. Циклоферон снизил данный показатель на 26,4%. Сочетание токоферола с циклофероном привело к снижению количества МДА - на 25,8%. У крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу, количество малонового диальдегида увеличилось на 95,4% по сравнению с контролем. Фармакологическая коррекция α-токоферол-ацетатом снизила данный показатель на 56,7%, циклофероном - на 59,6%, а сочетанное их действие привело к снижению количества МДА на 57,6%. Также следует отметить, что действие этих препаратов снизило показатели МДА по сравнению с контролем: α-токоферол на 15,5%; циклоферон на 19,6%; их совместное действие - на 17,0%.
Определение промежуточных продуктов ПОЛ в плазме крови - ацетилгидроперекисей, диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов
Наибольшее снижение количества диеновых конъюгатов было выявлено при введении α-токоферола и сочетании α-токоферола с циклофероном у крыс, находящихся в покое - 46,7%. (табл. 3).
Таблица 3
Показатели промежуточных продуктов ПОЛ в плазме
|
|
Группы животных |
Ацетилгидро-перекиси (ед. оптической плотности) |
Диеновые конъюгаты (ед. оптической плотности) |
Кетодиены и сопряженные триены (ед. оптической плотности) |
|
1 |
Контроль |
0,48 +/- 0,04 |
0,15 +/- 0,03 |
0,083 +/- 0,004 |
|
2 |
Токоферол |
0,32 +/- 0,06** |
0,08+/- 0,02* |
0,070 +/- 0,004* |
|
3 |
Циклоферон |
0,35 +/- 0,04*** |
0,10 +/- 0,02* |
0,073 +/- 0,003* |
|
4 |
Токоферол + Циклоферон |
0,33 +/- 0,04*** |
0,08 +/- 0,03* |
0,070 +/- 0,006* |
|
5 |
Стресс |
0,67 +/- 0,08 *** |
0,21 +/- 0,06*** |
0,116 +/- 0,007 *** |
|
6 |
Стресс + Токоферол |
0,29 +/- 0,07***000 |
0,125 +/- 0,04*0 |
0,072 +/-0,006 *000 |
|
7 |
Стресс + Циклоферон |
0,34 +/- 0,05**000 |
0,12 +/- 0,05*0 |
0,078+/- 0,005 *000 |
|
8 |
Стресс + Токоферол + Циклоферон |
0,33 +/- 0,06*000 |
0,10 +/- 0,06*0 |
0,069 +/- 0,006*000 |
Примечание. Статистическая значимость с группой «Контроль»: * - p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001.
Статистическая значимость с группой «Стресс»: 0-p < 0,05; 00 -p < 0,01; 000 - p < 0,001.
Значительное изменение показателей промежуточных продуктов ПОЛ наблюдали у стрессированной группы - увеличение ацетилгидроперекисей в ед. опт. плотности на 60,4%, диеновых конъюгатов и кетодиенов почти на 40% (табл. 3).
Воздействие α-токоферол-ацетата на стрессированную группу снизило показатели ацетилгидроперекисей на 56,7%, а диеновых конъюгатов - 40,5%. Действие циклоферона также привело к снижению данных показателей. Комбинация α-токоферола и циклоферона снизила количество ацетилгидроперекисей на 50,7%, диеновых конъюгатов - на 52% и кетодиенов и сопряженных триенов - на 40,5%.
Заключение
Полученные нами результаты - повышение интенсивности перекисного окисления липидов у стрессированных старых организмов - отражают общую тенденцию липидной пероксидации во всем организме, в том числе головном мозге. Иммобилизационный стресс старых животных привел к значительному увеличению показателей ПОЛ - значительно повысилось количество МДА - на 45,8% по сравнению с контролем. У крыс, находящихся в покое, и стрессированных иммобилизацией крыс, получавших α-токоферол, циклоферон и их комбинацию, было достоверно обнаружено снижение скорости спонтанного ПОЛ, АСК-зависимого ПОЛ, уровня МДА в гомогенатах тканей головного мозга и плазме крови, а также промежуточных продуктов ПОЛ - ацетилгидроперекисей, диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов.
Рецензенты:
Зурнаджан С.А., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой оперативной хирургии и топографической анатомии ГБОУ ВПО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Астрахань;
Фельдман Б.В., д.б.н., заведующий кафедрой биологии и ботаники ГБОУ ВПО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Астрахань.