Цель работы
В сравнительном аспекте изучить содержание адреналина (А), норадреналина (НА), дофамина (ДА), серотонина (С), 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК) и гистамина (Г) в саркоме 45 (С-45), расположенной интралиенально, на этапе метастазирования и в саркоме 45, расположенной подкожно и неметастазирующей.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на 35 белых беспородных крысах-самцах массой 230-270 г. 1-ю группу составили крысы через 1 неделю после подкожной перевивки С-45 (7 шт.), 2-ю группу - крысы через 2 недели после подкожной перевивки С-45 (7 шт.), 3-ю группу - крысы через 3 недели после подкожной перевивки С-45 (7 шт.), 4-ю группу - крысы через 4 недели после подкожной перевивки С-45 (7 шт.), 5-ю группу - крысы через 5 недель после введения С-45 в селезенку (7 шт.). Подкожную перевивку саркомы 45 осуществляли по стандартной методике. Модель экспериментального метастазирования в печень воспроизводили по следующей схеме. Предварительно за 3-4 недели до перевивки С-45 под кожу живота выводили селезенку. Затем путем интралиенальной инъекции помещали опухолевые клетки в орган (0,1 мл взвеси С-45 в физиологическом растворе, 1×106), где впоследствии развивался первичный опухолевый узел, метастазирующий в печень [2].
Из-за разных сроков выхода опухолей и различной динамики их роста сопоставить концентрации биогенных аминов в обеих опухолях в хронологическом порядке не представляется возможным. Поэтому у крыс с интралиенальным расположением опухоли мы выбрали срок исследования 5 недель, так как в этот период, по нашему предположению, С-45 начинает давать метастатические отсевы. У крыс с подкожным расположением опухоли аналогичной гистоструктуры, не дающей метастазов, были выбраны сроки через 1, 2, 3 и 4 недели после перевивки для определения патогенетической роли биогенных аминов в росте злокачественной опухоли.
Размеры опухолей измеряли штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях: V=А × В × С, см3, где А - ширина, В - длина, С - высота опухоли в сантиметрах.
Крыс умерщвляли путем декапитации на гильотине. Извлекали опухоли; 100 мг ткани промывали 1×фосфатно-солевым буфером (PBS), гомогенизировали в 1×PBS и оставляли на ночь при -20°С. В дальнейшем для полного разрушения клеточных мембран проводили два цикла замораживания-оттаивания. Полученную суспензию центрифугировали 5 мин при 5000 g (2-8°С). Перед исследованием образцы размораживали и еще раз центрифугировали. Определение биогенных аминов осуществляли методом ИФА с применением стандартных тест-систем ELISA, США.
Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи параметрического критерия Стьюдента на персональном компьютере посредством программы STATISTICA 10.0 и непараметрического критерия Вилкоксонна-Манна-Уитни. Достоверными считали различия между двумя выборками при р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
1. Особенности динамики роста гематогенно метастазирующей и неметастазирующей саркомы 45.
Метастазирующая С-45. До второй недели включительно от момента перевивки саркомы 45 в селезенку опухолевый узел в органе не визуализировался. Через 5 недель - время предположительного выхода метастатических узлов печени, размер (вес) первичной опухоли в селезенке составлял 18,54 ± 5,23 см3 (12,5 ± 3,5 гр.); через 7 недель - 26,64 ± 7,92 см3 (15,0 ± 4,3 г).
Неметастазирующая С-45. Через 1 неделю после перевивки размер (вес) опухоли составлял 117,2 ± 31,8 мг, через 2 недели - 3,46 ± 0,3 г, через 3 недели - 3,99 ± 0,09 см3 (4,50 ± 0,0 г), через 4 недели - 15,69 ± 3,2 см3 (9,25 ± 0,5 г).
2. Особенности статуса биогенных аминов метастазирующей и неметастазирующей саркомы 45.
Содержание биогенных аминов в ткани саркомы 45 (нг/грамм ткани) с подкожным и интралиенальным расположением опухоли
|
биогенные амины локализация С-45/сроки исследования |
А |
НА |
ДА |
С |
5-ОИУК |
Г |
|
|
Подкожная |
1 неделя |
21,93±6,33 |
36,46±1,04 |
160,53±10,53 |
1,80±0,18 |
1300,93±157,00 |
1607,7±62,50 |
|
2 недели |
16,57±6,00 |
18,10±1,721 |
192,21±25,48 |
1,52±0,46 |
1531,93±73,04 |
159,78±64,321 |
|
|
3 недели |
12,60±2,75 |
9,50±0,301,2 |
193,37±55,83 |
1,52±0,02 |
1270,10±57,742 |
482,71±8,691,2 |
|
|
4 недели |
25,57± 6,373 |
22,94±1,051,3 |
221,14±31,65 |
0,87±0,121,3 |
1444,77±33,673 |
1004,18± 189,821,2,3 |
|
|
Интралиенальная |
5 недель |
45,15 ± 21,431,2,3 |
22,87±4,581,3 |
280,74±48,471,2 |
0,70±0,081,2,3 |
1093,08± 265,571,2,4 |
608,85± 50,421,2,3,4 |
Примечание. 1 - достоверные отличия от 1 недели роста С-45 подкожно, 2 - достоверные отличия от 2 недели роста С-45 подкожно, 3 - достоверные отличия от 3 недели роста С-45 подкожно, 4 - достоверные отличия от 4 недели роста С-45 подкожно.
Как видно из таблицы 1, в нашем исследовании не было зарегистрировано достоверных колебаний А в подкожной опухоли в процессе ее роста с 1-ю по 3-ю неделю. Лишь через 4 недели уровень этого КА увеличивался в 2 раза по сравнению с предыдущим сроком наблюдения, но не отличался от исходных величин. Уровень А в опухоли, расположенной интралиенально, более чем в 1,7 раза превышал концентрацию А в опухоли, расположенной подкожно, на всех сроках наблюдения (таблица).
Динамика НА при подкожном росте опухоли была более выражена, чем А (таблица). Уже через 2 недели его содержание уменьшалось в 2 раза, через 3 недели - еще в 1,9 раза. Следовательно, к началу 4-й недели величина этого показателя снижалась в целом в 3,8 раза. К концу 4-й недели уровень НА увеличивался в 2 раза, но оставался ниже исходных значений (таблица). Содержание НА в опухоли, расположенной в селезенке, не отличалось от аналогичного показателя в опухоли, расположенной подкожно, на последнем сроке наблюдения (таблица).
Уровень ДА достоверно не изменялся в опухоли, растущей подкожно. В то же время содержание ДА в опухоли с интралиенальным положением было в 1,7 и в 1,5 раза больше по сравнению с 1-й и 2-й неделями роста подкожной опухоли соответственно (таблица).
Большая концентрация А в опухоли, расположенной интралиенально, может быть обусловлена особенностями иннервации самой селезенки, адренергический компонент вегетативной нервной системы которой представлен очень широко [1]. Сам факт большого содержания А свидетельствует, на наш взгляд, о создании оптимальных условий для метастазирования опухоли, поскольку установлено, что А избирательно усиливает кровоток в опухоли за счет увеличения капиллярного кровотока в ней [5]. Гипонорадренергия характерна для саркомы объемом 15,7-18,6 см3 любой локализации. В то же время интралиенальное расположение опухоли обеспечивает ее высоким резервным пулом ДА.
Концентрация С в неметастазирующей саркоме 45 падала только к концу 4-й недели, что соответствовало уровню С в метастазирующей опухоли (таблица). Количество 5-ОИУК в опухоли, растущей подкожно, колебалось незначительно: уменьшалось в 1,2 раза через 3 недели и восстанавливалось к концу 4-й недели. Содержание 5-ОИУК в опухоли, растущей внутри селезенки, было в среднем в 1,3 раза меньше, чем в подкожно расположенной (таблица). Следовательно, в первом случае (в неметастазирующей опухоли) гипосеротонинергия сочеталась с увеличением 5-ОИУК, что свидетельствовало об усилении активности ферментативной системы, участвующей в инактивации С. Во втором случае (в метастазирующей опухоли) речь шла скорее всего об истощении субстрата С.
Максимальная концентрация Г регистрировалась на 1-м сроке наблюдения за подкожной саркомой. Через 2 недели количество Г резко (более чем в 10 раз) падало, а с конца 3-й недели начинало расти, но не достигало исходных величин к концу 4-й недели. Содержание Г в опухоли, расположенной интралиенально, было в 1,6 раза меньше, чем в подкожной на последнем этапе ее развития.
Меньшее содержание Г в метастазирующей саркоме такого же размера, как и неметастазирующей, указывало на большую агрессивность и склонность к метастазированию такой опухоли. Установлено, что рак яичников, который, как известно, обладает высоким метастатическим потенциалом, также характеризуется сниженным содержанием гистамина в опухолевой ткани [4].
Заключение
Таким образом, злокачественные опухоли, помещенные в отличные от привычных условия существования, приобретают новые свойства, обусловленные спецификой органа, в котором они развивались, и вследствие этого становятся более агрессивными. Однако доказана роль биогенных аминов как в развитии и росте неоплазмы, так и ее метастатическом потенциале.
Рецензенты:
Шихлярова А.И., д.б.н., профессор, руководитель лаборатории изыскания новых противоопухолевых средств ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону;
Геворкян Ю.А., д.м.н., профессор, руководитель отделения абдоминальной онкологии № 2 ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону.