Нами разработана комбинация препарата «Противоспаечный гель» на основе аквакомплекса глицеросольвата титана и раствора минерала бишофит очищенного для профилактики образования послеоперационных спаек в брюшной полости, обладающий полифункциональным характером действия, доступностью и экономичностью сырья природного происхождения, что, в свою очередь, значительно снижает затраты на лечение данных заболеваний [1, 4, 10].
С момента формирования идеи о создании нового лекарственного препарата процесс его разработки неразрывно связан с проведением доклинических исследований. Такие исследования позволяют оценить эффективность того или иного вещества или их комбинации и выбрать наиболее оптимальный состав будущего лекарственного препарата. После утверждения его состава проводят доклинические исследования безопасности и эффективности [5, 8, 9].
Государственная регистрация лекарственного препарата осуществима лишь при условии детального изучения его специфической фармакологической активности и безопасности на этапе экспериментальных исследований. В России эти исследования проводятся в соответствии с приказом Министерства промышленности и торговли Российской Федерации от 14 июня 2013 г. № 916 « Об утверждении правил организации производства и контроля качества лекарственных средств».
Доклиническое исследование лекарственного средства включает в себя биологические, микробиологические, токсикологические и другие исследования лекарственного средства путем применения научных методов оценок в целях получения доказательств безопасности, качества и эффективности лекарственного средства [2].
Целью исследования является изучение хронической токсичности противоспаечного геля на этапе доклинического изучения.
Материалы и методы
Экспериментальное исследование проводилось в соответствии с общепринятыми правилами и правилами лабораторной практики GLP.
Содержание животных находилось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986; директива 86/609/EEC). Температура воздуха в виварии поддерживалась на уровне +20 - +24оС. Влажность воздуха в виварии была не более 65 %, освещение - совмещенное [6].
Хроническую токсичность противоспаечного геля проводили на конвенциональных белых крысах 3,5-4 месячного возраста. Подопытных группам животных противоспаечный гель вводили интрагастрально в дозах: 0,2 г/кг (соответствует экспериментально - терапевтической дозе), 1,0 г/кг (соответствует промежуточной дозе, которая в 5 раз превышала терапевтическую) и 2,0 г/кг (соответствует токсической дозе, которая превышала терапевтическую в 10 раз). Контрольным животным интрагастрально вводили препарат тизоль (основа противоспаечного геля) в дозе 2 г/кг, курсом 1 месяц.
Взвешивание животных проводили на электронных весах МW - 120 (Корея) каждые десять дней от начала эксперимента. Вес крыс выражали в г.
Результаты исследований подвергали статистической обработке в программе Microsoft Excel и Statistica 6.0. с использованием t-критерия Стьюдента. Из элементов описательной статистики вычислялись: среднее арифметическое значение (М), стандартная ошибка среднего (m), стандартное отклонение.
Дизайн исследования
Влияние противоспаечного геля при курсовом введении крысам в течение 1-го месяца оценивали по общему состоянию, прибавки массы тела, пищевой, питьевой и поведенческой активностей, периферической крови, функциональным, биохимическим и патоморфологическим исследованиям.
По ходу эксперимента проводили наблюдения за общим состоянием животных, их поведением и потреблением корма и воды. Общее состояние животных оценивали по поведению, состоянию шерстного покрова, кожных и слизистых покровов, динамике массы тела.
Для исследования поведенческой активности животных в тесте «открытое поле» животное помещали в центральный квадрат установки, наблюдения вели в течение 3 мин. Учитывали: количество пересеченных квадратов - горизонтальная активность (ГДА); вертикальных стоек - вертикальная активность (ВДА); заглядываний в напольные отверстия - исследовательская активность (ИА); актов груминга (Гр.); актов дефекаций - по числу болюсов (ЭА).
Запись электрокардиограммы проводили через 1 месяц введения препарата, и через 1 месяц его отмены во втором стандартном отведении на тепловом трехканальном электрокардиографе ЭК3Т - 02 «АКСИОН» (Удмуртия, Ижевск). Для проведения биохимических исследований забранную кровь центрифугировали на центрифуге при 3000 об/мин и микропипеткой отделяли плазму. В плазме крови животных определяли содержание глюкозы, общего белка, трансаминаз, мочевины, креатинина.
О функции почек судили по содержанию мочевины и креатинина в плазме крови животных, а также функциональной пробе с феноловым красным. О функциональной активности печени судили в исследованиях нагрузочного теста с красителем бромсульфалеин (Хазанов А.М., 1968; Сандоре В.Ю. и соавт., 1976; Израйлет Л.И. и соавт., 1976).
Результаты исследований подвергали статистической обработке в программе Microsoft Excel, достоверность результатов оценивали с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования
По результатам наблюдений за состоянием животных, получавших противоспаечный гель в дозах 0,2; 1,0; и 2,0 г/кг (соответственно подопытные группы 1; 2 и 3) в течение одного месяца, особых изменений относительно 1-ой группы контрольных крыс, получавших тизоль в дозе 2 г/кг, не обнаружено. Все подопытные группы крыс были практически одинаковы в отношении состояния шерстного покрова, слизистых, потреблению пищи и воды, поведения. При этом у подопытных животных во 2-й и 3-й группах отмечались элементы седации, тенденции снижения подвижности и реакций на внешние раздражители.
В период введения вещества динамика изменений была положительной у всех животных, включенных в эксперимент. При этом достоверных различий в динамике прироста массы тела контрольных животных у всех подопытных групп не выявлялось. Отмечались лишь незначимые тенденции меньшей динамики прибавки массы тела у крыс самцов во 2-й и 3-й подопытных группах, нивелирующиеся до контрольных значений в течение месяца после отмены введения им противоспаечного геля.
Результаты исследований поведенческой активности крыс в тесте «Открытое поле» видны гендерные различия в поведенческой активности крыс, получавших противоспаечный гель в течение 1 месяца.
Результаты изучения электрокардиограмм крыс особых различий в показателях электрофизиологической активности миокарда у крыс в подопытных группах и группе контроль - 1 не зарегистрировано ни в период месячного интрагастрального введения противоспаечного геля, ни в период отмены его введения.
Результаты биохимических исследований плазмы крови крыс отмечены как однонаправленные, так и гендерные различия.
Результаты изучения влияния противоспаечного геля на биохимические показатели плазмы крови крыс-самцов
|
Биохимические параметры |
Контроль (интактный) |
Контроль - 1 Тизоль 2 г/кг |
Группа 1 (0,2 г/кг) |
Группа 2 (1 г/кг) |
Группа 3 (2 г/кг) |
|
Глюкоза (ммоль/л) |
4,9±0,63 |
4,2±0,21 |
7,1±1,40 |
6,5±0,93 |
5,2±0,95 |
|
Общий белок (г/л) |
94,4±4,19 |
79,6±3,12 |
84,4±3,77 |
88,9±4,09 |
64,4±0,63* |
|
Креатинин (ммоль/л) |
158,7±19,96 |
180,3±27,92 |
157,1±27,42 |
162,0±31,14 |
118,0±14,56 |
|
Щелочная фосфатаза (мккат/л) |
1,9±0,19 |
1,2±0,17 |
1,7±0,22 |
2,0±0,57 |
1,4±0,07 |
|
Мочевина |
5,6±0,43 |
6,8±0,44 |
7,2±0,61 |
7,0±0,19 |
6,2±0,49 |
|
Аланин - аминотрансфераза (мккат/л) |
0,5±0,09 |
0,4±0,00 |
0,4±0,03 |
0,4±0,02 |
0,5±0,02 |
|
Аспартат - аминотрансфераза (мккат/л) |
0,6±0,07 |
0,5±0,02 |
0,5±0,04 |
0,5±0,07 |
0,7±0,11 |
|
Холестерин (ммоль/л) |
1,7±0,35 |
1,6±0,23 |
1,0±0,08 |
1,8±0,32 |
1,3±0,24 |
Примечание: * - изменения достоверны относительно группы интактного контроля при Р.<0,05.
Установлены в разной степени выраженности, но однонаправленное повышение в плазме крови у подопытных крыс самцов уровня глюкозы на 69,0 % (p > 0,05); 54,8% (p > 0,05) и 23,8% (p > 0,05), соответственно во всех группах, и у крыс самок на 17,3 % (p > 0,05); 25,0 % (p > 0,05) и 17,3% (p > 0,05), соответственно группам 1, 2 и 3. Различными были изменения белкового обмена.
Результаты изучения влияния противоспаечного геля на поглотительно-выделительную функцию печени (проба с бромсульфалеином) существенных изменений в группах опыт и контроль не обнаружено ни в период введения противоспаечного геля, ни после его отмены.
На основании проведенных исследований можно заключить, что при месячном курсе перорального введения крысам противоспаечного геля в дозах 0.2; 1,0 и 2,0 г/кг не оказывает патологического влияния на состояние внутренних органов крыс. Выявляющееся полнокровие венул в легких, миокарде, головном мозге, почках, печени было обратимо, нивелировалось после отмены и может лишь свидетельствовать об активации кровоснабжения данных органов. Наиболее отчетливые изменения наблюдались у крыс под действием противоспаечного геля, вводимого в дозе 2 г/кг. Вместе с тем данные эффекты были также обратимы и могут, вероятно, свидетельствовать о повышенной организации защитных реакций данных органов и возможно - о влиянии исследуемого вещества на данные органы - как на «орган - мишень».
Выводы. Проведено изучение 1 месячной хронической токсичности вещества противоспаечный гель при интрагастральном введении половозрелым крысам самкам и самцам. По результатам хронических исследований установлено отсутствие патологического влияния на основные гомеостатические константы животных. Отдельные электрокардиографические, гематологические и биохимические изменения, выявленные в период введения вещества крысам, не выходили за рамки физиологических норм и восстанавливались в течение месяца после отмены его введения до уровня контрольных значений.
Таким образом, на основании проведённых исследований можно сделать вывод, что противоспаечный гель при внутрижелудочном введении крысам в дозах 0,2 г/кг (соответствует экспериментально - терапевтической дозе); 1,0 г/кг соответствует промежуточной дозе, которая в 5 раз превышала терапевтическую, и 2,0 г/кг (соответствует токсической дозе, которая превышала терапевтическую в 10 раз) не оказывает патологического действия на основные гомеостатические константы, т. е. является безопасным.
Рецензенты:
Пантюхин А.В., д.фарм.н., доцент, заведующий кафедрой фармацевтической технологии и биотехнологии ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского Минздрава России, г. Саратов;
Петров А.Ю., д.фарм.н., к.х.н., профессор, заведующий кафедрой фармации ГБОУ ВПО УГМУ Минздрава России, г. Екатеринбург.