Актуальность темы. Согласно современным представлениям об этиологии синуситов, ключевым звеном в их развитии является инфекционное поражение условно-патогенными микроорганизмами.
Состав микрофлоры и ее вирулентность сказываются на клиническом проявлении патологического процесса. Если при безлихорадочном течении процесса высеваются в основном представители нейссерий, коринебактерий, эшерихий, клебсиелл, то при более тяжелой клинической картине заболевания чаще обнаруживаются стрептококки и стафилококки [2, 3].
Учитывая это, знание патогенных свойств микроорганизмов, высеваемых при гнойных верхнечелюстных синуситах, может способствовать прогнозу течения заболевания.
При установлении путей распространения микроорганизмов, вызывающих инфекционные заболевания или какие-либо патологические процессы, важную роль играет использование различных свойств бактерий, так называемых эпидемиологических маркеров [4]. Установление таких маркеров - эпидемиологическое маркирование - осуществляется различными методами.
В качестве эпидемиологического маркера бактерий может рассматриваться их потенциальная патогенная способность. Такая способность выражается в наличии у бактерий факторов вирулентности (патогенности), которые разграничиваются по механизму действия на факторы адгезивности, персистенции и токсичности [5, 6].
Целью настоящей работы было изучение факторов вирулентности бактерий, вызывающих гнойный верхнечелюстной синусит.
Для этого необходимо решить следующую задачу: исследовать распространение факторов вирулентности у бактерий в зависимости от формы заболевания и источника их выделения.
Материалы и метода. Исследования проводились на базе стоматологической поликлиники Кабардино-Балкарского государственного университета в 2014-2015 гг.
Материалом для исследования служили 127 штаммов аэробных и факультативно анаэробных бактерий, выделенных из различного патологического материала от 115 больных острыми и хроническими верхнечелюстными синуситами.
Адгезивную способность бактерий определяли с использованием формалинизированных эритроцитов человека группы 0(I)Rh+, согласно методике В. И. Брилиса и соавт. (1986). Определяли средний процент адгезии, коэффициент участия эритроцитов и индекс адгезивности микроорганизмов (ИАМ), на основании чего бактерии дифференцировались на неадгезивные (ИАМ<1,75), низкоадгезивные (ИАМ= 1,76-2,5), среднеадгезивные (ИАМ = 2,51-4,0) и высокоадгезивные (ИАМ > 4,0). Подсчет вели на 50 эритроцитах.
Гемагглютинирующую активность исследовали в реакции гемагглютинации на плексигласовых панелях с 3 % взвесью свежих эритроцитов человека группы 0(I)Rh+ и барана. D-Маннозорезистентная гемагглютинация выявлялась при добавлении к взвеси эритроцитов 1,5 % D-маннозы. Способность бактерий адсорбировать краситель конго красный устанавливалась на 1,5 % питательном агаре с 0,02 % казаминовых кислот и 0,01 % конго красного.
Антилизоцимную активность исследовали по методике О. В. Бухарина и соавт. (1984), основанной на принципе «отсроченного антагонизма», в диапазоне концентраций от 1 до 8 мкг/мл. Для определения лизоцимной активности бактерий использовался тот же принцип «отсроченного антагонизма», тест-культурой служил тот же штамм микрококка.
Определение гемолитической активности бактерий проводили на питательном агаре с 3-5 % отмытых в растворе Хенкса эритроцитов кролика. Тиолзависимые гемолизины выявляли на питательном агаре с 0,002 % L-цистеина. Культуры засевались уколом, гемолиз учитывали через 24-48 часов.
Результаты исследования. Проведено исследование выделенных штаммов бактерий на наличие у них факторов вирулентности. Определялись факторы вирулентности, относящиеся по механизму действия к 3 различным группам: факторы адгезивности, персистенции и токсичности.
У исследованных штаммов определяли адгезивность на эритроцитах человека группы 00(I)Rh+ , наличие гемагглютинирующей способности в отношении эритроцитов человека и барана, а также способности бактерий адсорбировать краситель конго красный.
При рассмотрении результатов исследования адгезивности бактерий в отношении эритроцитов человека к адгезивноактивным культурам мы относили штаммы, для которых величины ИАМ составляли > 2,5, т.е. штаммы, которые можно рассматривать как среднеадгезивные. Такими штаммами оказались 80 исследованных культур, или 63±4,3 %. У представителей разных систематических групп частота обнаружения адгезивноактивных штаммов колебалась в пределах от 40,0 % до 100,0 %.
Наиболее часто адгезивноактивные штаммы встречались среди протеев, псевдомонад и эшерихий - 93,3±6,4 %, 92,8±6,9 %, 83,3±15,2 % соответственно. Реже всего такие штаммы были представлены у морганелл и стафилококков - 40±21,9 % и 50±6,5 % соответственно. Адгезивно-активные штаммы встречались у стафилококков достоверно реже, чем у эшерихий, псевдомонад и протеев.
Высокоадгезивные штаммы, имеющие значения ИАМ > 4,0, среди исследованных культур составили 16,5 %. Всего выявлен 21 такой штамм. Высокоадгезивные штаммы наиболее часто встречались среди культур Escherichia, Pr.mirabilis, Pseudornonas - на их долю приходилось соответственно 50, 41,7 и 28,6 % среди всех исследованных штаммов, или 60, 45,4 и 30,8 % среди адгезивноактивных культур. Обращает на себя внимание тот факт, что среди штаммов S.epidermidis высокоадгезивные штаммы составляли значительную часть культур - около 1/3 адгезивноактивных штаммов, превосходя в этом отношении штаммы S.aureus.
В то же время среди изученных культур выявлено лишь 8 штаммов, не обладавших адгезивной способностью в отношении эритроцитов человека (ИАМ < 1,75), что составляет 6,5 %. Такие штаммы обнаружены среди культур S.aureus (4 штамма), S.epidermidis (3 штамма) и Pseudornonas (1 штамм).
Средние значения величины ИАМ у изученных культур составляли 2,94 ± 0,06. Эти значения соответствовали среднеадгезивным штаммам. Колебания средних значений показателя ИАМ у культур, представляющих разные систематические группы, составляли 2,31-3,46.
Наиболее высокие значения ИАМ отмечены у протеев, псевдомонад и энтеробактеров, причем эти величины у протеев и энтеробактеров достоверно превышали аналогичные значения у стафилококков (Р<0,05). У штаммов Str.pyogenes и Str.faecalis наблюдались достоверные различия в величине ИАМ - культуры Str.faecalis имели более высокие значения этого показателя.
Гемагглютинирующая способность у изученных культур была выражена слабее. Способностью агглютинировать эритроциты человека и барана обладали по 50 штаммов (39,4±4,3 %). Результаты агглютинации бактериями эритроцитов человека и барана совпадали у 19 штаммов (14,9 % исследованных культур), причем такие штаммы встречались среди различных бактерий. Выявленные у изученных бактерий гемагтлютинины относились в большинстве случаев к маннозорезистентным - в отношении эритроцитов человека маннозорезистентные гемагглютинины обнаружены у 28 штаммов (56 % гемагглютинирующих штаммов), а в отношении эритроцитов барана - у 31 штамма (62 %).
Способностью адсорбировать краситель конго красный обладали 58 штаммов (45,7 ± 4,4 %). Это свойство было лучше всего выражено у стафилококков (75,8 %) и энтеробактеров (66,7 %), хуже всего - у морганелл, цитробактеров, протеев.
При окончательном установлении адгезивной способности у изученных бактерий мы исходили из следующих критериев: адгезивными считались культуры, обладавшие сочетанием по крайней мере 2 показателей адгезивных свойств, из которых один - ИАМ > 2,5, а второй - гемагглютинирующая способность либо адсорбция конго красного. Кроме того, к адгезивным относили все штаммы, имевшие величины ИАМ 4,0 и выше. Исходя из указанных критериев, адгезивными признаны 70 штаммов или 55,1 %.
Адгезивные свойства бактерий, выделенных при острых и хронических гнойных верхнечелюстных синуситах, несколько различались между собой. Штаммы, выделенные при острых синуситах, характеризовались близкими значениями частоты обнаружения адгезивноактивных штаммов - 53,3-66,7 %. У культур, изолированных при хронических синуситах, наблюдались более значительные колебания показателя адгезивности - от 38,5 % до 93,3 %. Эти колебания были обусловлены в основном грамотрицательными бактериями.
Штаммы, выделенные при хронических гнойных верхнечелюстных синуситах, достоверно чаще агглютинировали эритроциты барана по сравнению со штаммами, изолированными при острых процессах (44,115,1 % против 26,5±7,5 %). В то же время у культур, изолированных при острых гнойных верхнечелюстных синуситах, агглютинация эритроцитов человека отмечалась недостоверно чаще (52,9±8,5 % против 34,4±4,9 %), чем у культур, выделенных при хронических гнойных верхнечелюстных синуситах.
Маннозорезистентные гемагглютинины в отношении эритроцитов человека резко преобладали у штаммов, выделенных при острых гнойных верхнечелюстных синуситах (72,2 % гемагглютинирующих штаммов), тогда как у культур, изолированных при хронических процессах, такие штаммы составили 46,9 %. Аналогичная картина отмечена и в отношении агглютинации эритроцитов барана маннозорезистентные гемагглютинины выявлялись у культур, выделенных при острых и хронических гнойных верхнечелюстных синуситах, соответственно в 77,8 % и 58,5 % случаев.
Средние значения ИАМ у различных бактерий, выделенных при острых гнойных верхнечелюстных синуситах, были близкими и составляли 2,44-3,43. Доля адгезивных штаммов, установленных по комплексу изученных характеристик, в обеих рассмотренных группах была близкой - 53,8 % и 58,8 %.
Среди штаммов стафилококков, выделенных при острых процессах, адгезивными свойствами обладали в целом несколько больше штаммов, чем среди культур, выделенных при хронических процессах - 53,3-66,7 % против 38,5-50 %.
Полученные результаты показывают, что 55,1 % штаммов, выделенных при гнойных верхнечелюстных синуситах, обладают выраженными адгезивными свойствами.
Как показатель персистенции бактерий нами использована антилизоцимная активность. В результате проведенных исследований установлено, что такой способностью обладают 82 штамма, или 64,6±4,2 %. Среди представителей разных родов частота обнаружения антилизоцимактивных штаммов колебалась в широких пределах - от 14,3 % до 100 %.
Антилизоцимная способность выявлена у всех исследованных штаммов Pr.mirabilis и Morganella. Это свойство было слабо выражено у культур стрептококков - способностью нейтрализовать лизоцим обладали лишь по 1 из 7 исследованных штаммов Str. pyogenes и Str.faecalis. У стафилококков в целом антилизоцимная активность обнаружена у 65,5 % культур. Однако отмечены существенные различия в распространениии этого свойства между культурами S.aureus и S.epidermidis. У штаммов S.aureus антилизоцимная активность встречалась достоверно чаще, чем у S.epidermidis - 78,6±7,7 % против 53,3±9,1 %).
Средние значения уровня антилизоцимной активности у исследованных штаммов составили 2,75±0,26 мкг/мл, а у 82 антилизоцимактивных штаммов - 4,26±0,28 мкг/мл. Наиболее высокие значения этого показателя наблюдались у морганелл, протеев, энтеробактеров - 6,2, 4,4, 4,0 мкг/мл соответственно. Наиболее низким уровнем антилизоцимной активности характеризовались штаммы стрептококков, эшерихий и цитро-бактеров - 0,57, 1,83 и 2,2 мкг/мл соответственно. При анализе среднего уровня антилизоцимной активности антилизоцимактивных штаммов существенных различий между представителями разных систематических групп бактерий не установлено.
У культур S aureus уровень антилизоцимной активности достоверно превышал таковой у штаммов S.epidermidis (3,32±0,51 мкг/мл против 1,83±0,47 мкг/мл). Однако при рассмотрении антилизоцимактивных штаммов этих бактерий различий между ними практически не отмечалось.
У большинства исследованных штаммов (75,6 %) уровень антилизоцимной активности был средним и составлял 3-6 мкг/мл. Подобные соотношения отмечены почти у всех представителей исследованных бактерий. Лишь у эшерихий преобладали штаммы с низким уровнем антилизоцимной активности (1-2 мкг/мл), а у штаммов S.epidermidis такие культуры составили 50 %.
Антилизоцимная активность отмечалась у штаммов, выделенных при острых и хронических процессах с близкой частотой - 64,7 % и 64,5 %. Антилизоцимная способность у культур S.epidermidis, выделенных при острых гнойных верхнечелюстных синуситах, отмечалась достоверно чаще, чем у штаммов этих бактерий, выделенных при хронических процессах (75,0±15,3 % против 45,4±10,6 %). Распространение лизоцимной активности у бактерий рассмотренных двух групп было близким.
При рассмотрении уровня антилизоцимной активности у штаммов, выделенных при острых и хронических гнойных верхнечелюстных синуситах, отмечено, что большинство культур имели средний либо высокий уровень этой активности. Лишь у штаммов S.epidermidis, выделенных при острых процессах, культуры с низким уровнем антилизоцимной активности составляли половину антилизоцимактивных штаммов.
Между культурами бактерий, выделенных из верхнечелюстных пазух и из полости среднего уха, по распространению антилизоцимактивных штаммов существенных различий не установлено. Средний уровень антилизоцимной активности у бактерий, выделенных из верхнечелюстных пазух и из полости среднего уха, существенно не различался.
Рассмотренные штаммы, выделенные из разных полостей больных с гнойными верхнечелюстными синуситами, не различались по распределению культур с разным уровнем антилизоцимной активности.
Проведенные исследования показали, что 64,6 % культур, выделенных от больных с гнойными верхнечелюстными синуситами, обладают антилизоцимной активностью.
В качестве факторов токсичности у выделенных бактерий проведено определение двух типов гемолизинов - α-гемолизинов и тиолзависимых гемолизинов. Гемолитические свойства обнаружены у 74 штаммов из 127 исследованных (58,2±4,4 %). Среди выявленных гемолизинов отмечено резкое преобладание α-гемолизинов. Такие гемолизины обнаружены у 71 штамма (55,9±4,4 %). Тиолзависимые гемолизины продуцировали лишь 3 штамма (2,4±1,3 %). Один из этих штаммов принадлежал к S.aureus, второй - к Str.pyogenes, третий - к Enterobacter.
Существенных различий в частоте обнаружения гемолитических свойств между бактериями разных родов не выявлено. У стафилококков такими свойствами обладали 63,8+6,3 % штаммов, у стрептококков - 50,0±13,3 %, у энтеробактерий - 52,5±7,9 %, у псевдомонад - 57,1±13,2 % .
У представителей разных видов стафилококков (S.aureus и S.epidermidis) частота обнаружения гемолитической активности была близкой - 67,8 и 60,0 % соответственно. У всех культур Str.pyogenes выявлены α-гемолизины, тогда как ни у одного штамма Str.faecalis такие свойства не были установлены. У штаммов, выделенных при острых гнойных верхнечелюстных синуситах, гемолитические свойства были выражены несколько лучше, чем у культур, изолированных при хронических формах заболевания.
У штаммов стафилококков, выделенных при острых процессах, частота обнаружения гемолизинов была выше, чем у культур, изолированных при хронических процессах - 73,9±9,1 % против 57,1±8,3, однако эти различия были недостоверными. Аналогичная картина наблюдалась и у стрептококков.
Выводы:
1. Факторы вирулентности продуцировали 88,2 % выделенных штаммов бактерий.
2. Адгезивными свойствами характеризовались 55,1 % изученных культур, антилизоцимной активностью - 64,6 %, гемолитической способностью - 58,2 %.
3. Отмечены определенные различия в распределении факторов вирулентности у различных представителей исследованных бактерий. Грамотрицательные бактерии чаще продуцировали факторы вирулентности по сравнению грамположительными.
Рецензенты:
Хараева З. Ф., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБОУ ВПО «Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х. М. Бербекова», г. Нальчик;
Блашкова С. Л., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой терапевтической стоматологии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», РТ, г. Казань.