Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Неослабевающий интерес к особенностям метаболизма трипсиновых протеиназ, в частности компонентов калликреин-кининовой и фибринолитической систем (ККС и ФС), а также молекулярным механизмам взаимодействия между собой и с универсальными ингибиторами, объясняется их участием в регуляциимногих физиологических функций организма [3,8,9]. Калликреин считается центральным регулятором многих систем ограниченного протеолиза, но регуляторныйфермент может также стать причиной или участником патологических событий в организме [9,12]. Плазмин известен своей важной ролью в регуляции функций и плотности межклеточного матрикса, ангиогенезе, созревании половых клеток, санации полостей, тканей и жидкостей организма, развитии воспаления и злокачественных опухолей [3]. Универсальные ингибиторы α-2-макроглобулин (α2М) и α-1-протеиназный ингибитор (α1ПИ) регулируют активность протеолиза и являются молекулярной составляющей эндогенной защиты организма.

Асцитическая жидкость (АЖ) при различных заболеваниях яичников является ценной для изучения биологической средой поражённого организма, содержащей белкаоколо 20-50 г/л [1,2].

Асцит может развиться при любом воспалительном заболевании органов брюшной полости, но, вследствие быстротечности большинства таких патологий, выраженный и длительный асцит наблюдается только при туберкулезном перитоните [1]. В связи с этим для сравнения с АЖ, образующейся при асцитической форме рака яичников, нами использован подобный материал, полученный при операции по поводу туберкулёза придатков (ТП). Рак яичников (РЯ), в силу его тяжёлого течения и высокой смертности, является одной из наиболее агрессивных опухолей.У большинства больных РЯ заболевание в основном остаётся ограниченным брюшной полостью.ТП является типичным воспалительным заболеванием, для которого характерна экссудативная реакция [1].Часто АЖ, образующаяся при раке яичников, по внешнему виду и составу не отличается от экссудатов другого происхождения [1,7]. В представляемом исследовании также не было выявлено явных различий между двумя видами исследуемого материала.Ограниченный протеолиз и его ингибирование в асцитической жидкости ранее не исследовались.

Цель исследования: изучениепротеиназо-ингибиторного равновесия вАЖбольных раком яичников и туберкулёзом придатков для определения его роли в развитии заболеванийи точек приложения медикаментозной терапии.

Материалы и методы исследования

Во всех случаях получено письменное добровольное информированное согласие больных и этического комитета РНИОИ на использование операционного материала для научных исследований. ИзученаАЖ больных злокачественными опухолями яичников без лечения(n=26,цистаденокарциномы, T3-4N0M0), результаты сравнивали с полученнымив АЖбольных туберкулёзом придатков до лечения (ТП, n=11). Медиана возраста женщин составила 56,5±2,6 лет, все находились в различных периодах менопаузы. Внешнихразличий асцитической жидкости при указанных патологиях не отмечено: во всех случаях она была непрозрачной, в 29,3% случаев имелся лёгкий осадок, составляющий около 20-22% объёма. Розовый оттенок (геморрагическаясоставляющая) присутствовал примерно в 64-72%случаев при каждом заболевании. В нативной АЖ исследовали трипсиноподобные протеиназы и ингибиторы с последующим пересчётом на 1 мг белка в 1 мл (по Лоури).Кинетику ферментов ККС определяли спектрофотометрически по скорости гидролиза этилового эфира N-α-бензоил-L-аргинина и гиппурил-L-лизина;плазминоген, плазмин, α2М и α1ПИ - методами ИФА на стандартных тест-наборах. Для сравнения использовали плазму крови 32 практически здоровых доноров.Статистический анализ производили с помощью программы Statisticav.10и t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

            Исследование АЖ при РЯ и ТПпоказало наличие активности трипсиноподобных протеиназ и универсальных ингибиторов.По общей активности трипсиновых протеиназ (ОАТ) в АЖотличий практически не было, но активность калликреина (К) и плазмина (П), содержание их проферментов прекалликреина (ПК) и плазминогена (ПГ), активность кининазы 1 (карбоксипептидазы N, КПN), а также содержание ингибиторов α2М и α1ПИ достоверно различались (табл. 1).

Учитывая состав АЖ, мы сочли возможным сравнить полученные данные с плазмой крови (табл. 1,2), т.к. считается, что выпот происходит в основном из повреждённых воспалением сосудов [1,2,7]. В крови при злокачественных новообразованиях установлен дефицит прекалликреина [6], что может определять его низкое содержание и в АЖ (табл. 1). В ткани злокачественной опухоли количество ПК увеличивается, сравнительно с линией резекции [5], поэтому при тканевом выпоте в брюшную полость в АЖ неизбежно увеличилось бы и содержание прекалликреина.

Таблица 1

Компоненты кининовой системы, фибринолитической системы

и универсальные ингибиторы в асцитической жидкости

Таблица 2

Баланс протеиназ и ингибиторов в асцитической жидкости

Примечание для табл. 1 и 2: 1- достоверно, сравнительно с плазмой крови (р<0,01);

2 -достоверно относительно данных незлокачественного заболевания (р<0,05).

При цистаденокарциноме яичника, на III-IV стадиях, асцит является доминирующим синдромом [1,2,7]. Как и при туберкулезном перитоните, жидкость в одних случаях оказывается экссудатом, в других - транссудатом. Учитывая высокое содержание белка в исследуемой АЖ при обоих заболеваниях (табл. 1), очевидно следует считать её экссудатом. Для хронических туберкулёзных перитонитов характерным считается преобладание лимфоцитов в асцитической жидкости [1]. В условиях раковой интоксикации, в асцитической жидкости содержатся циркулирующие иммунные комплексы и множество белков, в основном изменённой конформации, которые не могут эффективно выполнять свои функции [2]. Этим же автором установлено, что до проведения специализированного лечения у больных раком яичников в сыворотке крови и в асцитической жидкости выявляются значительные метаболические нарушения.

При анализе активности ККС в АЖ становится очевидным, что баланс её компонентов (табл. 2) и при туберкулёзе придатков, и при раке яичников далёк от физиологического. Понятно, что нет возможности изучить нормальный баланс ККС в асцитической жидкости, поскольку уже само её присутствие в брюшной полости означает патологическое состояние. Однако в обстоятельном обзоре A. Pavlopoulouetal. [9] подчёркивается, что во всех тканях и жидкостях организмов любого уровня организации активных калликреинов в несколько раз меньше, чем их проферментов, причём цифры соотношения неактивной и активной форм тем выше, чем выше эволюционная ступень развития живого организма. В трудах Г.А. Яровой и других исследователей ККС неоднократно упоминается о том, что активность свободного калликреина крови в норме стремится к минимальным цифрам вплоть до нуля, значительно повышаясь лишь при патологии, тогда как содержание прекалликреина менее подвержено колебаниям, поскольку он является одним из факторов свёртывания, обязательным метаболитом стабильности эндотелия и межклеточного матрикса.В тканях, особенно железистых, активность калликреина и содержание прекалликреина могут быть несколько выше, т.к. они необходимы для нормального метаболизма [8].

Баланс ПК/К в АЖ, близкий к единице при ТП и РЯ (табл. 2), свидетельствует о значительном «перерасходе» запаса прекалликреина, сравнительно с плазмой крови, вплоть до его истощения, в связи с чем система ПК-К лишена возможности выполнять свои регуляторные и адаптивно-защитные функции.Соотношение скорости образования и распада свободных кининов (К/КПN,табл. 2) достоверно различалось в АЖ при злокачественном и незлокачественном заболеваниях яичников, причёмв последнем случае оно соответствовало данным плазмы крови.Это, по-видимому,связано с некоторыми различиями в содержании прекалликреина (табл. 1), полное истощение которого при РЯ могло сдерживать освобождение калликреина, даже при достаточном количестве активирующих факторов (белки, иммунные комплексы, раковые токсины, клетки крови и т.д.).При использовании одного субстрата в одинаковых условиях проведения реакции становится возможным оценитьпроцентное содержание калликреина в общей активности трипсиновых протеиназ. Это соотношение приведено в таблице 2 (К/ОАТ), и оно при раке яичниковбыло на 18,6% ниже (р<0,05), чем при туберкулёзе придатков,и в последнем случае достоверность различийс нормой крови не установлена, несмотря на значительно увеличенную активность обоих показателей (табл. 1). Следовательно, при РЯ в асцитической жидкости в большей степени, чем при ТП, активирован весь спектр трипсиновых протеиназ, в связи с чем снижалась доля калликреина в практически одинаковой ОАТ (табл. 1). Тем не менее, патологическая активация ККС считается опасной для любых тканей и жидкостей организма, поскольку многие калликреины вовлечены в разные стадии развития рака и его прогрессии[9].

Касательно ФС, установлено, что в АЖ при ТП содержание плазминогена выше, чем плазмина в 2,2 раза, а при РЯ коэффициент баланса ПГ/П составил 0,6 в связи с высоким содержанием плазмина и резким снижением количества профермента (табл. 1,2). 

При анализе изменений плазминогена и плазмина, очевидно, что их баланс при туберкулёзе придатков, несмотря на значительную активацию, близок к физиологическому.Такое же соотношение ПГ/П определяется, например, в крови доноров (табл. 2), в тканях интактных яичников и их доброкачественных опухолей[10].В АЖ при раке яичников ПГ меньше, чем П в 1,7 раза (табл. 1), что говорит о патологическом дисбалансе предшественник/фермент (ПГ/П, табл. 2). Повышенная активность плазмина характерна для крови, тканей и биологических жидкостей при злокачественных новообразованиях [4,6,10].Именно плазмин,кроме растворения фибрина, разжижает межклеточный матрикс, повреждает гистогематические барьеры и клеточные мембраны, является непосредственным активатором прекалликреина, трипсиногена, проэластазы и остальныхпроферментов сериновых протеиназ, в том числефакторов роста, а также матриксных металлопротеиназ, коллагеназ и др.[3].

Ингибиторная активность в АЖ при РЯ по α2М и α1ПИ была достоверно выше, чем при ТП (табл. 1). Баланс К/α2М и ОАТ/α1ПИ при РЯ оказался достоверно низким, относительно ТП (табл. 2), что объяснимо с точки зрения высокой активности α2М и α1ПИ при РЯ и небольшого запаса прекалликреина.Несмотря на это, баланс П/α2М при РЯ в 1,5 раза выше, чем при ТП в связи с большим содержанием плазмина.

При выраженном воспалительном процессе, всегда сопровождающем туберкулёз, экссудация происходит вследствие резкого повышения проницаемости гистогематических барьеров, как следствие усиления процесса выпота(фильтрации) плазмы крови и микровезикулярного транспорта. При злокачественных новообразованиях воспалительный процесс начинается на поздних стадиях, при некрозе участков опухоли и повреждении прилегающих тканей, диссеминации процесса с вовлечением в процесс больших участков микрососудистой сети. Выход жидкости и растворённых белков во всех случаяхосуществляется в местах соприкосновения эндотелиальных клеток. Фенестры увеличиваются при расширении сосудов, при сокращении контрактильных структур и округлении эндотелиальных клеток, что обусловлено прямым действием брадикинина [8].Как уже упоминалось, количество последнего в обоих случаях исследования АЖ было повышенным, судя по высокой активности калликреина (табл. 1) - абсолютно специфичной кининогеназы [8].Результатом экссудации является заполнение очага воспаления и интерстициальных пространств экссудатом. При сильном нарушении проницаемости, сопровождаемом разрушением стенки микрососуда, из плазмы выходят белки с высокой молекулярной массой (α2-глобулины, фибриноген)[1].

Таким образом, при ТП действие экзогенных этиологических факторов (микобактерии туберкулёза и их токсины), вызывая первичную альтерацию, приводит к длительному росту проницаемости микрососудов и воспалению с участием трипсиновых протеиназ и универсальных ингибиторов. В результате развивается некроз эндотелиальных клеток на уровне артериол небольшого диаметра, капилляров и венул, что ведет уже к стойкому повышению их проницаемости в очаге воспаления с выходом высокомолекулярных белков в интерстиций[1,7]. Сохранение нормального равновесия в системе ПГ-П АЖ, при высоком содержании компонентов, скорее подтверждает их активное участие в воспалительном процессе, чем свидетельствует о нормальном метаболизме.Биологический смысл экссудации состоит в отграничении очага через сдавление кровеносных и лимфатических микрососудов вследствие интерстициального отёка, а также в разведении факторов цитолиза в очаге воспаления для предотвращения избыточной альтерации[7].В этой связи возрастает необходимость санации интерстициальных пространств плазмином, протеиназой широкого спектра действия [3], при повышенной активности которого трудно провести грань между защитой и повреждением.

При РЯ истощение ККС и острый дисбаланс ФС, даже в присутствии большего количества ингибиторов, исключают защитно-адаптивные функции исследуемых систем в асцитической жидкости, обеспечиваютучастие их компонентов в патологическом процессе как повреждающих факторов, способствующих распространению злокачественного процесса[7-9,12].Значительное содержание в АЖ α2М и α1ПИ при РЯ может быть следствием их поступления не только из крови и ткани яичника, но и из злокачественной опухоли, что меняет их свойства и препятствует контролю протеолиза [11].

Заключение

Васцитической жидкости и при РЯ,и ТПобнаружены ферменты трипсинового типа и универсальные ингибиторы с резким нарушением протеиназо-ингибиторного баланса. Исключение составила активация системы ПГ-П, сохранившая нормальное соотношение «предшественник/фермент» при туберкулёзе придатков. Тем не менее в последнем случаенедостаточное количество эндогенных ингибиторов не может остановить развивающееся воспаление.

При раке яичников в АЖимеет местозначительнаяактивность системограниченного протеолиза и ингибиторовс качественным нарушением соотношения всехизученных показателей. Высокуюактивность плазмина при истощении профермента можно считать специфичной не только для агрессивной неоплазмы [4,10], но и для экссудата в брюшную полость при диссеминации рака яичников.Способность злокачественной опухоли секретировать не только ферменты, но и ингибиторы известна [11] и подтверждается нашими результатами. Это свидетельствует о серьёзномискаженииметаболических связей в ККС, ФС, обнаруженных в асцитической жидкости больных РЯ, а также их компонентов с системой универсальных ингибиторов и изменении статуса изученных систем с физиологическогона патологический.

Наличие ферментов ограниченного протеолиза, установленное в АЖ при ТП и РЯ, в частности трипсиновых протеиназ, а также универсальных ингибиторов (и первые, и вторые - обязательные участники воспаления), вполне ожидаемо и требует как системной, так и локальной медикаментозной коррекции экзогенными ингибиторами протеиназ даже после удаления АЖ, поскольку продолжающийся выпот будет обеспечивать новые поступления белков, в том числе ферментов, следовательно, и распространение патологического процесса.

Шихлярова А.И., д.м.н., профессор  ФГБУ РНИОИ МЗ РФ, г.Ростов на Дону;

Непомнящая Е.М., д.м.н., профессор ФГБУ РНИОИ МЗ РФ,  г.Ростов на Дону.