Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,006

MECHANISMS OF ERYTHROPOIETIN INFLUENCE ON ADAPTIVE IMMUNITY INDICATORS IN EXPERIMENTAL THERMAL INJURY

Osikov M.V. 1 Kishkin A.M. 1 Fedosov A.A. 1
1 South Ural State Medical University of Health Ministry of Russia
The study examines 54 white nonlinear rats divided into 3 groups: intact animals, animals with thermal injury (TI), animals with thermal injury treated with erythropoietin (EPO). Skin burn injury was modeled by 100°C heat source application for 30 seconds (III-A degree burn) covering 4% of the surface. EPO ("Recormon" INN: epoetin beta, «Roche», Switzerland) was introduced intraperitoneally in a total dose of 1500 IU/kg. The amount of T-lymphocytes and B-lymphocytes with CD3 and CD45RA monoclonal antibodies respectively was determined in the rats’ peripheral blood. Apoptosis and necrosis of lymphocytes was assessed by staining of cells with fluorochrome-conjugated annexin V (Annexin-5-FITC) and 7-aminoaktinomitsin D (7-AAD). A flow cytometer «Navios» («Beckman Coulter», USA) is used to analyze the stained cells. Th1- and Th2-dependent response was evaluated in hypersensitivity reactions and the number of antibody-forming cells respectively in the rats’ spleens after immunization. The number of T-lymphocytes and B-lymphocytes decreases in the blood, Th1-dependent and Th2-dependent immune response is inhibited, number of lymphocytes in the blood with signs of apoptosis and necrosis increases on the 3rd day after TI. Reduction of the number of T-lymphocytes and B-lymphocytes in the blood, inhibition of Th1-dependent and Th2-dependent immune response increases as the number of lymphocytes with signs of apoptosis and necrosis increases. The use of EPO leads to a partial or full restoration of the number of T-lymphocytes and B-lymphocytes in the blood, Th1-dependent and Th2-dependent immune response, reducing the number of lymphocytes in the blood with signs of apoptosis and necrosis. Restoring the number of T-lymphocytes and B-lymphocytes in the blood, Th1-dependent and Th2-dependent immune response in case of TI with administration of EPO is associated with decreased number of lymphocytes in the blood with signs of apoptosis and necrosis.
erythropoietin.
adaptive immunity
thermal injury

В динамике иммунологической реактивности при термической травме (ТТ) выделяют как минимум три фазы: период ранней иммунодепрессии, захватывающий первые дни после ожога; период компенсации, характеризующийся усилением иммунореактивности; период поздней иммунодепрессии, возникающий только после обширных повреждений. Сведения об изменении иммунного статуса в ранние сроки ТТ противоречивы, большинство исследователей отмечают активацию фагоцитов, изменение активности комплемента, концентрации в сыворотке иммуноглобулинов и др. опсонинов, депрессию клеточного звена адаптивного иммунитета, неоднозначны сведения о цитокиновом профиле. В то же время дисфункция иммунной системы при ТТ является причиной повышенной восприимчивости к условно-патогенной микрофлоре, гнойно-септических осложнений, септического шока, расширения зоны вторичной альтерации, полиорганной недостаточности и летальности, поэтому терапевтические подходы в комбустиологии в первые сутки ведения пациентов должны включать иммунокорригирующие подходы. В этом отношении перспективным фармакологическим агентом может выступить эритропоэтин (ЭПО). Ранее нами продемонстрировано протекторное влияние эритропоэтина (ЭПО) на иммунный статус при хронической почечной недостаточности, а также на врожденный иммунитет при ТТ [1-7].  Интерес к ЭПО обусловлен его плейотропными эффектами, включающими, кроме иммунотропного, кардиотропный, нефроцитопротекторный, антиоксидантный, стимулирующий репарацию тканей.

Цель работы - исследовать механизм влияния экзогенного ЭПО на показатели адаптивного иммунитета при экспериментальной ТТ.

Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 54 белых нелинейных крысах массой 180-220 г, находящихся в стандартных условиях вивария на типовом рационе в соответствии с нормами, утвержденными Приказом Минздрава СССР № 1179 от 10.10.1983 г., при свободном доступе к пище и воде при 12-14-часовом световом дне. Все манипуляции с экспериментальными животными выполнялись в соответствии с правилами гуманного отношения к животным, методическими рекомендациями по их выведению из опыта и эвтаназии. Экспериментальные животные разделены на 3 группы: группа 1 - интактные животные (n=18), группа 2 - животные с термической травмой (n=18), группа 3 - животные с термической травмой, которым вводили ЭПО (n=18). Для создания модели ТТ использовали плоскодонный стеклянный стакан из химического стекла с диаметром дна 4 см, наполненный дистиллированной водой с температурой 100 °С, время контакта с кожей для моделирования ТТ ІІІА степени составило 30 с. Площадь ожога вычисляли по формуле площади круга, в нашем эксперименте она составила 12,56 см². Для расчета поверхности тела у крыс использовали формулу Мее-Рубнера в модификации Lee: S=К•W0,6, где S - поверхность тела в квадратных сантиметрах, К - коэффициент, равный 12,54, W - вес животного в граммах. Площадь поверхности тела животных в нашем эксперименте составила 336,44±12,67 см². Так как абсолютная площадь ожога была одинаковой во всех случаях (12,56 см²), то относительная площадь ожога составила 3,97±0,14%, т.е. около 4%. ЭПО в составе препарата «Рекормон» (МНН: эпоэтин бэта, Roche, Швейцария) вводился внутрибрюшинно, начиная с 1-х суток, ежедневно в дозе 500 МЕ/кг массы в течение 3 дней, суммарная доза 1500 МЕ/кг. Контрольной группе животных с ТТ вводилось эквиобъемное количество стерильного физиологического раствора. Исследования проводили на 3-и сутки. Забор крови проводили под общим ингаляционным наркозом (диэтиловый эфир) путем пункции левого желудочка сердца в вакуумные пробирки фирмы «Вакуэт» (Австрия).

Количество популяций лимфоцитов в периферической крови у крыс определяли методом прямой иммунофлуоресценции цельной крови с использованием моноклональных антител CD3 (клон 1F4) - экспрессируется на Т-лимфоцитах, CD45RA (клон OX-33) - экспрессируется преимущественно на В-лимфоцитах. Анализ окрашенных клеток проводили на проточном цитофлуориметре Navios (Beckman Coulter, США), результат выражали в 109/л крови. Оценку гуморального иммунного ответа крыс проводили по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, результат выражали в абсолютном количестве и в пересчете на 106 ядросодержащих клеток в селезенке. Реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, оценивали по выраженности воспалительного отека стопы волюмометрическим методом. Лимфоциты из периферической крови выделяли на двойном градиенте плотности фиколла и урографина («ДНК-технология», Россия), концентрацию лимфоцитов в суспензии доводили до 3•106/л. Гибель лимфоцитов оценивали при окрашивании клеток конъюгированным с флюорохромом аннексином V (Annexin-5-FITC) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD) (Beckman Coulter, США) на проточном цитофлуориметре Navios (Beckman Coulter, США), результат выражали в % клеток. Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows v.10.0. Проверку статистических гипотез проводили с использованием критериев Краскела-Уоллиса, Манна-Уитни, Вальда-Вольфовитца, наличие связи между показателями исследовали с помощью коэффициента корреляции Спирмена. Отличия считали значимыми при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. При экспериментальной ТТ в периферической крови количество Т-лимфоцитов (CD3+) снижается на 28%, количество В-лимфоцитов (CD45+) снижается на 27% средних значений в контрольной группе (таблица 1).

Таблица 1

Влияние эритропоэтина на показатели адаптивного иммунитета при термической травме (M±m)

Показатели

1 группа

Интактные

2 группа

ТТ

3 группа ТТ+ЭПО

CD3+, •109/л

3,14±0,12

2,25±0,16

p1-2<0,01

4,55±0,22

p1-3<0,01

p2-3<0,01

CD45+, •109/л

2,22±0,14

1,60±0

p1-2<0,01

2,55±0,07

p2-3<0,01

Интенсивность реакции ГЗТ, мл

0,36±0,03

0,28±0,04

p1-2<0,01

0,68±0,01

p1-3<0,01

p2-3<0,01

АОК в селезенке, • 104 ед.

192,19±24,69

22,31±3,07

p1-2<0,01

24,77±2,21

p1-3<0,01

АОК в селезенке, • 106 ЯСК

125,33±33,50

30,75±2,91

p1-2<0,01

64,54±14,37

p1-2<0,01

p2-3<0,01

Развитие лимфоцитопении сопровождается депрессией Th1-зависимого иммунного ответа, что проявляется снижением интенсивности реакции ГЗТ на 22% от средних значений в контрольной группе. Депрессия Th2-зависимого иммунного ответа презентируется снижением количества антителообразующих клеток в селезенке в абсолютных величинах в 8,7 раза от средних значений в контрольной группе, в пересчете на 106 ядросодержащих клеток в селезенке количество антителообразующих клеток снижается в 4,2 раза.

Одним из механизмов развития лимфоцитопении и депрессии Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа может выступать активация гибели иммунокомпетентных клеток. Результаты исследования гибели лимфоцитов периферической крови путем некроза и апоптоза представлены в табл. 2.

Таблица 2

Влияние эритропоэтина на показатели гибели лимфоцитов периферической крови при термической травме (M±m)

Показатели

1 группа

Интактные

2 группа

ТТ

3 группа ТТ+ЭПО

Интактные клетки (Annexin-5-FITC-/7-AAD-), % клеток

98,09±1,35

96,70±0,22

p1-2<0,01

97,75±0,20

p2-3<0,01

Ранний апоптоз (Annexin-5-FITC+/7-AAD-), % клеток

1,62±0,09

2,90±0,27

p1-2<0,01

2,00±0,22

p2-3<0,01

Поздний апоптоз/некроз (Annexin-5-FITC+/7-AAD+),  % клеток

0,10±0,03

0,15±0,02

 

0,10±0

 

Некроз (Annexin-5-FITC - / 7-AAD +), % клеток

0,19±0,03

0,25±0,07

p1-2<0,01

0,21±0,02

 

 

Установлено снижение представительства интактных клеток (Annexin-5-FITC-/7-AAD-), увеличение количества клеток с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD-), признаками некроза (Annexin-5-FITC - / 7-AAD +). С использованием корреляционного анализа установлено наличие обратной средней силы связи между количеством лимфоцитов в крови с ранними признаками апоптоза и количеством Т-лимфоцитов (коэффициент корреляции Спирмена R= - 0,45; р<0,05), В-лимфоцитов (R= - 0,41; р<0,05), интенсивностью реакции ГЗТ (R= - 0,57; р<0,05), количеством АОК в селезенке в пересчете на  106 ядросодержащих клеток (R= - 0,51; р<0,05). Кроме того, зафиксирована обратная слабая связь между количеством лимфоцитов в крови с признаками некроза и количеством Т-лимфоцитов (R= - 0,39; р<0,05), интенсивностью реакции ГЗТ (R= - 0,35; р<0,05).

Применение ЭПО при экспериментальной ТТ приводит к увеличению количества Т-лимфоцитов (CD3+) и В-лимфоцитов (CD45+) в периферической крови, причем количество Т-лимфоцитов становится выше, чем в группе интактных животных. Интенсивность реакции ГЗТ, отражающая выраженность Th1-зависимого иммунного ответа, в условиях применения ЭПО повышается и становится статистически значимо выше, чем в группе интактных животных. ЭПО повышает количество АОК в селезенке в пересчете на
106 ядросодержащих клеток, однако их количество не достигает значений в группе интактных животных.

Одним из механизмов влияния ЭПО на показатели адаптивного иммунитета при ТТ выступает ограничение апоптоза лимфоцитов. В условиях применения ЭПО повышается количество интактных лимфоцитов (Annexin-5-FITC-/7-AAD-), снижается количество клеток с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD-). По данным корреляционного анализа, наблюдается отрицательная средней силы связь между количеством клеток с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD-) и количеством Т-лимфоцитов (R= - 0,52; р<0,05), интенсивностью реакции ГЗТ (R= - 0,59; р<0,05) и отрицательная слабая связь с количеством В-лимфоцитов (R= - 0,33; р<0,05), количеством АОК в селезенке в пересчете на 106 ядросодержащих клеток (R= - 0,38; р<0,05).

По данным других исследователей, уже в раннем периоде после ТТ происходят выраженные дистрофические изменения в тимусе, вызывающие глубокую депрессию Т-клеточного звена иммунитета, которая проявляется как в снижении общего количества Т-лимфоцитов, так и различных субпопуляций с изменением их функциональной активности. Степень снижения числа Т-лимфоцитов находится в определенной зависимости от тяжести ТТ [9; 10]. Определенную роль в подавлении активности Т-лимфоцитов при ТТ, в частности ответ CD4+ наивных клеток на антигенную стимуляцию и формирование клона антиген-специфических Т-лимфоцитов, играют Т-регуляторные лимфоциты (Tregs). В Т-лимфоцитах при ТТ нарушены механизмы внутриклеточной сигнализации, опосредованные митоген-активируемыми протеинкиназами и Са2+ [8]. Протеинкиназа С опосредует цАМФ-зависимые  эффекты простагландина Е2 в подавлении активности Т-лимфоцитов после ТТ. Механизм нарушения функции Т-лимфоцитов окончательно не определен, о чем свидетельствуют многочисленные сведения, зачастую противоречивого характера. Одним из механизмов подавления функциональной активности Т-лимфоцитов при ожогах выступает повышение концентрации в плазме протеина HMGB1 (high mobility group box-1), обратно коррелирующее с отношением CD4/CD8. Кроме повышенной гибели лимфоцитов по механизму апоптоза в качестве альтернативной причины Т-клеточной дисфункции рассматривается и другой механизм: активная супрессия вследствие раннего смещения цитокинового баланса в сторону противовоспалительных медиаторов. Причем выраженность апоптоза лимфоцитов, как было установлено в TUNEL-тесте у крыс при ТТ, зависит от уровня эндотоксинемии. Получены сведения о значимой корреляции полиморфизма гена CD14+ и Т-клеточного иммунитета, что, в частности, предрасполагает к развитию септических осложнений у ожоговых пациентов.

Наряду с изменениями клеточного иммунитета при ТТ происходит снижение количества В-лимфоцитов. Однако В-система характеризуется большей устойчивостью, изменение гуморального иммунного ответа характеризуется сдвигами в концентрации иммуноглобулинов. Большинство исследователей наблюдали уже на 1-3 сутки после ТТ снижение уровня Ig М, Ig А, а в случае глубоких ожогов увеличение содержания Ig G. Направленность и величина отклонений в уровне иммуноглобулинов зависит не только от активности антителообразующих клеток, но и от их количества, которое уменьшается в результате плазмореи, распада их вследствие повышения активности протеолитических ферментов.

Выводы

1.                  При экспериментальной термической травме в периферической крови снижается количество Т- и В-лимфоцитов, угнетается Th1- и Th2-зависимый иммунный ответ, увеличивается количество лимфоцитов в крови с признаками апоптоза и некроза.

2.                  Снижение количества Т- и В-лимфоцитов в крови, угнетение Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа прогрессирует по мере увеличения количества лимфоцитов с признаками апоптоза и некроза.

3.                  Применение эритропоэтина в суммарной дозе 1500 МЕ/кг приводит к частичному или полному восстановлению количества Т- и В-лимфоцитов в крови, Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа, снижению количества лимфоцитов в крови с признаками апоптоза и некроза.

4.                  Восстановление количества Т- и В-лимфоцитов в крови, Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа при экспериментальной термической травме в условиях применения эритропоэтина ассоциировано со снижением количества лимфоцитов в крови с признаками апоптоза и некроза.

Рецензенты:

Куренков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России,                   г. Челябинск;

Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологической химии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России,                    г. Челябинск.