Цель исследования - сравнительный качественный анализ извлечений из плодов Cucurbitamaxima Duch. для дальнейшего выбора органического растворителя с целью экстракции каротиноидов.
Объекты и методы. В качестве источника каротиноидов была использована мякоть плодов Cucurbitamaxima Duch. Основываясь на физико-химических свойствах этого класса БАВ и учитывая их растворимость [4, 6], в качестве экстрагентов были выбраны гексан, хлороформ и ацетон. Для выделения каротиноидов из сырья применили метод жидкостной экстракции с соотношением сырье:экстрагент - 1:5.
Методика получения извлечения. Мякоть плодов Cucurbitamaxima Duch. предварительно измельчали, добавляя гидрокарбонат натрия с целью нейтрализации органических кислот. Около 5,0 г измельченного сырья (точная навеска) трижды экстрагировали гексаном или хлороформом, или ацетоном порциями по 25 мл при постоянном помешивании в делительной воронке при комнатной температуре до обесцвечивания сырья. Полученные порции извлечений объединяли и подвергали качественному анализу.
В связи с тем, что каротиноиды являются светочувствительными соединениями, на всех этапах изолирования уменьшали воздействия света, оборачивая колбы и делительные воронки фольгой, а промежуточные продукты хранили в банках оранжевого стекла в темном месте.
Разделение суммы каротиноидов и качественный анализ полученных экстрактов проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), дополнительно для идентификации изолированных БАВ применяли метод УФ-спектрофотометрии.
Методика спектрофотометрического анализа. По 1 мл гексанового или хлороформного, или ацетонового извлечения помещали в мерные колбы вместимостью 25 мл и доводили объемы растворов до метки гексаном, хлороформом и ацетоном соответственно.
Для полученных растворов регистрировали спектры поглощения на спектрофотометре СФ-2000 в диапазоне от 250 до 700 нм в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм, в качестве растворов сравнения использовали гексан, хлороформ и ацетон соответственно.
Методика ТСХ анализа. На линию старта хроматографической пластинки «Sorbfil» размером 10×20 см наносили по 5 мкл гексанового или хлороформного, или ацетонового извлечений и раствора стандартного образца β-каротина, сушили при комнатной температуре в течение 5 мин, предохраняя пластинки с нанесенными образцами от действия света.
Пластинку помещали в хроматографическую камеру, насыщенную парами подвижной фазы.
В качестве подвижных фаз использовали следующие смеси растворителей:
- диэтиловыйэфир - петролейный эфир (3:1) - система I;
- петролейный эфир - диэтиловый эфир - кислота уксусная (85:15:1) - система II;
- петролейный эфир - гексан (10:1) - система III.
Когда фронт подвижной фазы проходил около 15 см, пластинку вынимали из камеры, сушили при комнатной температуре.
Детекцию пятен первоначально проводили по окраске зон адсорбции. Далее хроматограммы обрабатывали 10 % раствором кислоты фосфорномолибденовой и нагревали до 60 °С в течение 10 мин. Зоны адсорбции, соответствующие каротиноидам, проявлялись в виде синих пятен на зелено-желтом фоне [1].
Результаты и их обсуждение. Согласно литературным данным основной каротиноидный состав плодов Cucurbitamaxima Duch. представлен β-каротином, виолаксантином, кукурбитаксантином, α-крипоксантином, β-крипоксантином, лютеином, зеаксантином, неоксантиноми следовыми количествами других каротиноидов [8,9].
Электронные спектры поглощения растворов производных каротина характеризуются, как правило, тремя максимума или двумя максимумами и плечом в интервале длин волн от 270 до 550 нм. Антоциановые красители поглощают около 549 нм [4,5].
Спектры поглощения полученных гексанового и ацетонового извлечений имели по три максимума поглощения, которые находились в области, присущей каротиноидным соединениям: 429, 448, 474 нм в ацетоне и 426, 447, 472 нм в гексане. Спектр раствора хлороформного извлечения не имел выраженного «каротиноидного профиля», однако имелись максимумы поглощения при 408, 433 нм и плечо около 455 нм. На спектрах всех извлечений отсутствовали максимумы поглощения около 550 нм, характерные для антоцианов.
В соответствии с данными литературы спектр поглощения раствора β-каротина в ацетоне имеет максимумы при 429, 452, 478 нм, в тех же условиях для α-каротина - 424, 448, 476 нм, для зеаксантина - 430, 452, 479 нм, для неоксантина - 416, 440, 470 нм.
Растворы в гексане имеют следующие максимумы поглощения: для β-каротина - 425, 450, 477 нм; для α-каротина - 422, 445, 473 нм; для зеаксантина - 424, 449, 476 нм, неоксантина - 416, 438, 467 нм, для кукурбитаксантина - 427, 453, 483 нм.
Растворы в хлороформе: спектр раствора β-каротина - максимумы при 435,461, 485 нм; α-каротина - 433, 457, 484 нм; зеаксантина - 433, 462, 493 нм, неоксантина - 423, 448, 476 нм.
Кроме положений максимумов для идентификации каротиноидов методом спектрофотометрии используется расчет соотношения высот максимумом поглощения, в частности отношение третьего максимума ко второму, выраженное в процентах - III/II [7, 8, 10].
После сравнения максимумов поглощения полученных спектров с литературными сведениями и положениями максимумов оптической плотности на спектре раствора СО β-каротина установлено, что гексановое извлечение преимущественно содержит β-каротин, что подтверждается величиной соотношения III/II - 25,9 %, согласно данным литературы этот параметр должен составлять - 25 % [7, 8]. Наиболее вероятным сопутствующим каротиноидом является α-каротин, однако соотношение III/II для этого каротиноида должно быть 55 %.
Анализ характера спектра поглощения ацетонового экстракта показал, что по положению первого максимума (428 нм) он наиболее близок к спектру поглощения β-каротина, второго (448 нм) и третьего (476 нм) - к спектрам поглощения α-каротина и зеаксантина. Соотношение III/II для спектра раствора β-каротина в ацетоне должно быть - 15 %, расчетное значение составило - 9 %.
Далее все извлечения были проанализированы методом ТСХ в системах растворителей: диэтиловыйэфир-петролейный эфир (3:1) - I; петролейный эфир-диэтиловый эфир-кислота уксусная (85:15:1) - II, петролейный эфир-гексан (10:1) - III.
Система I позволила разделить шесть соединений каротиноидного типа в гексановом извлечении с коэффициентами подвижности: 0,024; 0,065; 0,230 (β-криптоксантин); 0,336 (зексантин); 0,451 (лютеин); 0,746 (β-каротин).
По четыре соединения были зафиксированы в хлороформном извлечении: 0,065; 0,230 (зексантин); 0,443 (лютеин); 0,750(β-каротин) и ацетоновом экстракте - 0,066; 0,123; 0,234 (зексантин); 0,750 (β-каротин).
В системе растворителе II были разделены по два соединения в гексановом извлечении: 0,284; 0,850 (β-каротин); в хлороформном: 0,31; 0,845 (β-каротин); и ацетоновом: 0,284; и 0,845 (β-каротин).
Смесь растворителей III разделить компоненты всех трех извлечений не позволила, т.к. нанесенные извлечения в виде зон адсорбции находились на линии страта.
Таким образом, результат анализа извлечений в хроматографической системе I показал, что качественный состав гексанового извлечения значительно шире, при этом составы ацетонового и хлороформного извлечений можно считать практически идентичными. Система II показала наличие двух каротиноидов в каждом из извлечений, причем, для всех трех экстрактов был идентифицирован β-каротин. Система растворителей III не дала разделения каротиноидов.
Выводы. По результатам спектрофотометрического анализа для дальнейшей работы в качестве экстрагентов были выбраны гексан и ацетон. В ходе исследования извлечений методом ТСХ установлено, что наибольшее число каротиноидных соединений содержит гексановое извлечение из сырья. Сравнение результатов анализа извлечений методами спектрофотометрии и ТСХ, показал, что необходимо повысить очистку всех получаемых извлечений.
Рецензенты:
Оганесян Э.Т., д.фарм.н., профессор, заведующий кафедрой органической химии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ МЗ, г. Пятигорск;
Компанцев В.А., д.фарм.н., профессор, профессор кафедры неорганической химии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ МЗ, г. Пятигорск.