Цель исследования
Изучение ассоциации полиморфного варианта АТФ-связанного кассетного (АВС) трансмембранного белка - транспортера холестерина ABCG5 (rs4131229) - с биохимическими показателями у больных с желчнокаменной болезнью.
Материалы и методы
Материалом для исследования послужили образцы ДНК больных желчнокаменной болезнью в стадии обострения и здоровых доноров в возрасте от 23 до 80 лет, проживающих в г. Уфа. Группа больных, наблюдавшихся в гастроэнтерологическом и хирургическом отделениях ГБУЗ РБ ГКБ № 21 г. Уфа Республики Башкортостан, составила 180 индивидов, из которых 105 имели диагноз «хронический калькулезный холецистит» - ХКХ (1-я группа), 75 - «острый калькулезный холецистит» - ОКХ (2-я группа)), у которых проведен анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта АТФ-связанного кассетного (АВС) трансмембранного белка - транспортера холестерина ABCG5 (rs4131229). Диагностику ЖКБ проводили на основании данных общеклинического обследования, ультразвукового исследования желчного пузыря. В качестве контроля исследована группа здоровых лиц без каких-либо признаков заболеваний желудочно-кишечного тракта, а также сердечно-сосудистой патологии, обусловленной атеросклерозом, состоящая из 167 человек. Распределение по половому признаку среди больных было следующим: мужчин - 35, женщин - 145, среди индивидов контрольной группы: мужчин - 33, женщин - 134.
Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции [5]. Амплификацию исследованных локусов ДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе «GeneAmp PCR System 2720» производства компании «Applied Biosystems» (США). Определение нуклеотидных замен проводили методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ). Перечень исследованных локусов, последовательности праймеров, размеры амплифицируемых фрагментов, названия рестриктаз представлены в таблице 1.
Таблица 1
Полиморфные варианты, последовательность праймеров, номенклатура аллелей анализируемого ДНК-локуса
Ген |
Полиморф-ный вариант, dbSNP |
Праймеры, 5' - 3' (ссылка) |
Рестриктаза, аллели (размер фрагментов п.н.) |
ABCG5 |
i7892 T>C rs4131229 |
ACTTCTGTCTGTGGCTTGCATT GAAAGAGATTGGAACCTAGAAG (Li Q., et al., 2012) |
Hha I T- 203 C - 126+77 |
Результаты оценивали методом электрофореза в 7%-ном полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете. Статистическую обработку результатов исследования проводили c применением программного обеспечения MS Office Excel. Оценка различий между двумя исследуемыми выборками проводилась по критерию Стьюдента и U-критерию Манна-Уитни. Все пациенты предварительно дали письменное согласие на участие в проводимом исследовании.
Результаты и обсуждение
У больных ЖКБ и лиц контрольной группы проведено изучение связи полиморфного варианта АТФ-связанного кассетного (АВС) трансмембранного белка - транспортера холестерина ABCG5 (rs4131229) с биохимическими показателями у больных желчнокаменной болезнью и здоровых доноров.
Результаты анализа ассоциации исследуемого полиморфного варианта rs4131229 гена ABCG5 с биохимическими показателями крови (М ± m) больных ЖКБ по сравнению с контрольной группой представлены в таблице 2.
Таблица 2
Результаты анализа связи исследуемого полиморфного варианта rs4131229 гена ABCG5 с биохимическими показателями крови (М ± m) больных ЖКБ по сравнению с контрольной группой
Больные |
Генотип |
Показатели липидов крови (М ± m) (ммоль/л) |
N |
|||
Общий холестерин |
АЛТ |
АСТ |
Общий билирубин |
|||
Больные с ХКХ |
ТС (n=42) |
5,64±0,29 Р=0 |
50,86±12,38 Р=0,005 t=2,903 |
48,9±12,17* P=0,017 t=2,435 |
16,61±2,61* Р=0,04 t=2,091 |
105 |
СС (n=21) |
5,93±0,22 Р=0 |
24,84±2,67 P=0 |
24,81±2,24 P=0,164 t=1,445 |
17,46±1,39* P=0,006 t=2,904 |
||
ТТ (n=42) |
5,25±0,21 Р=0 |
28,68±4,75* P=0,004 t=2,807 |
26,39±3,97 Р=0,058 t=1,925 |
14,23±0,74* Р=0,005 t=2,858 |
||
Больные с ОКХ |
ТС (n=38) |
5,29±0,19 Р=0 |
135,2±31,6 Р=0 |
103,4±24,71 Р=0 |
29,27±5,36* Р=0,002 t=3,235 |
75 |
СС (n=17) |
5,39±0,25* P=0,001 |
70,88±25,97* P=0,007 |
66,47±18,99 P=0 |
34,49±6,88 P=0 |
||
ТТ (n=20) |
5,83±0,28 P=0 |
98,8±29,39* P=0,008 t=2,795 |
88,65±28,39* P=0,026 t=2,316 |
63,75±27,44 P=0,067 |
||
Контрольная группа |
СТ (n=73) |
4,33±0,11 |
15,1±1,17 |
19,29±1,49 |
11,37±0,67 |
167 |
СС (n=25) |
4,87±0,03 |
11,1±1,03 |
20,05±2,39 |
11,99±1,27 |
||
ТТ (n=69) |
4,33±0,11 |
15,1±1,17 |
19,29±1,49 |
11,37±0,67 |
Примечание: n - численности групп; N - объем выборки, * - по сравнению с контролем р <0,05.
При сравнении групп больных и контроля обнаружено, что носители генотипа ТС полиморфного варианта rs4131229 гена ABCG5 с ХКХ имели статистически значимый высокий уровень фермента аспартатаминотрансферазы (АСТ), у пациентов с гомозиготным генотипом ТТ гена ABCG5 заболевание протекало с нормальным уровнем аланинаминотрансферазы (АЛТ). Уровень общего билирубина статистически значимо не был отклонен от референтных значений у носителей всех генотипов полиморфного варианта rs4131229 гена ABCG5 с хроническим калькулезным холециститом по сравнению с контролем.
Выявлено, что носители генотипа ТС полиморфного варианта rs4131229 гена ABCG5 с острым калькулезным холециститом имели статистически значимый высокий уровень общего билирубина по сравнению с контролем. У пациентов с ОКХ и гомозиготным СС генотипом наблюдался достоверно выше референтных значений показатель общего холестерина и АЛТ в сыворотке крови. У индивидов с генотипом ТТ определялся статистически значимый цитолитический синдром: уровни АЛТ и АСТ были повышены в несколько раз.
Путь транспорта холестерина включает захват холестерина липопротеина высокой плотности (ХС ЛПВП) печенью и его выведение с желчью. Мембранные белки- транспортеры ABCG5 и ABCG8, находящиеся в печени, кишечнике [4,2] и эпителиальных клетках желчного пузыря [7], регулируют транспорт липидов на различных уровнях, препятствуют избыточному захвату холестерина в энтероцитах, участвуют в катаболизме холестерина и способствуют его транспорту в желчь. Генетически обусловленный дефицит этих транспортеров является причиной ситостеролемии, т.е. низкой скорости выведения стеролов с желчью и накопления в крови и тканях холестерина и растительных стеролов [1].
Li Q. et al. (2012), проводя исследования в популяции китайцев, показали, что мужчины, носители аллеля rs4131229*T гена ABCG5, характеризуются снижением концентрации общего холестерина, холестерина ЛПВП, триглицеридов и отношения ApoA1/ApoB [3].
Выводы
- Хронический калькулезный холецистит у носителей генотипа ТС полиморфного варианта rs4131229 гена ABCG5 протекал с высоким уровнем АСТ и не превышающим норму общим билирубином, а у больных с гомозиготным генотипом ТТ гена ABCG5 ХКХ характеризовался нормальными значениями АЛТ и общим билирубином. У носителей гомозиготного генотипа СС гена ABCG5 ХКХ также протекал с нормальными показателями общего билирубина.
- У индивидов с гетерозиготным генотипом ТС полиморфного варианта rs4131229 гена ABCG5 острый калькулезный холецистит, в отличие от ХКХ, протекал с повышенным уровнем общего билирубина. При гомозиготном СС варианте больные с ОКХ, в отличие от пациентов с ХКХ, имели повышенные показатели общего холестерина и АЛТ. У носителей ТТ генотипа гена ABCG5 с ОКХ, как и в 1-й группе, зарегистрирован высокий уровень АЛТ и АСТ в сыворотке крови.
Рецензенты:
Зулкарнеев Р.Х., д.м.н., профессор кафедры пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Уфа;
Загидуллин Н.Ш., д.м.н., профессор кафедры пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Уфа.