Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,931

APPLICATION OF VARIOUS METHODS WITH DETERMINING TANNINS IN LEAVES OF A SKUMPIYA TANNING (COTINUS COGGYGRIA SCOP. )

Gritsenko A.I. 1 Gubanova L.B. 1 Popova O.I. 1
1 Pyatigorsky Medical-Pharmaceutical Institute, branch GBOU VPO «Volgograd State Medical University»
В настоящей статье обсуждаются результаты применения различных методов при определении дубильных веществ в листьях скумпии кожевенной (CotinuscoggygriaScop.). Объектом исследования служили высушенные образцы сырья листьев скумпии кожевенной, заготовленные в 2014 году в фазу цветения растения на юго-восточном склоне горы Машук в городе Пятигорске Ставропольского края. Проведено количественное определение дубильных веществ по методике ГФ XI для анализа листьев скумпии кожевенной. Разработана методика количественного определения дубильных веществ в листьях скумпии кожевенной методом спектрофотометрии в пересчете на танин. Проведена сравнительная оценка определения дубильных веществ в листьях скумпии кожевенной двумя методами: перманганатометрии и спектрофотометрии. Метод спектрофотометрии рекомендован для включения в современную нормативную документацию на данный вид сырья.
This article discusses the results of applications of various methods when determining tannins in leaves of a skumpiya tanning (CotinuscoggygriaScop.). As object of research the dried-up samples of raw materials of leaves of a skumpiya tanning, the blossomings of a plant wereprepared in 2014 in a phase on a southeast slope of the mountain Mashuk in the city Pyatigorsk of Stavropol Area. Quantitative definition of tannins by the SP XI technique for the analysis of leaves of a skumpiya tanning is carried out. The technique of quantitative definition of tannins in leaves of a skumpiya tanning by a spektrophotometry method in terms of tannin is developed. The comparative assessment of definition of tannins in leaves of a skumpiya tanning is carried out by two methods: permanganatometry and spektrophotometry. The method of a spektrophotometry is recommended for inclusion in modern regulating documentation for this type of raw materials.
spectrophotometry
permanganatometry
Leaves of skumpiya tanning
tannins

К группе дубильных веществ (ДВ) относятся вещества растительного происхождения, которые представляют собой сложные органические соединения, являющиеся производными многоатомных фенолов с разнообразной химической структурой, начиная от простейших производных полифенолов и заканчивая более сложными высокомолекулярными производными, так называемыми флобафенами и флобатанинами. ДВ обладают вяжущим, противовоспалительным и кровоостанавливающим действием, поэтому поиск новых растительных источников ДВ, а также разработка и модификация методик их количественного определения в лекарственном растительном сырье (ЛРС) весьма актуальны [5,8].

В литературе имеется много сведений об определении ДВ в ЛРС методом перманганатометрии [4,5,7,10]. Метод Левенталя показал сравнительно хорошую воспроизводимость. Однако он характеризуется некоторой завышенностью результатов, что обусловлено субъективностью определения конца титрования по появлению золотисто-желтой окраски; сильной зависимостью результатов от интенсивности перемешивания титруемого раствора и освещения; зависимостью расхода перманганата калия от скорости титрования; неприемлемостью применения единого пересчетного коэффициента для растительного сырья, содержащего танино-катехиновую смесь [9]. Физико-химические методы сейчас чаще всего включают в современную нормативную документацию (НД) на ЛРС. Метод спектрофотометрии основан на образовании окрашенных комплексов ДВ с железо-тартратным реактивом [1,5]. Метод потенциометрического титрования позволяет не только оценить количественное содержание суммы дубильных веществ в ЛРС, но и дифференцировать конденсированные и гидролизуемые группы танинов [7]. Применение спектрофотометрического и потенциометрического методов выявило наибольшую сходимость результатов определения ДВ, причем с наименьшей погрешностью. Среди хроматографических методов высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) позволяет установить качественный и количественный состав отдельных компонентов [5]. Метод перманганатометрического титрования, включенный в Государственную Фармакопею (ГФ) X и XI изданий – метод Левенталя, измененный А.Л. Курсановым, основан на способности ДВ быстро окисляться в сильно разбавленном кислом растворе в присутствии индикатора индигосульфокислоты [3]. Однако, согласно данным литературы, наряду с ДВ происходит окисление и других групп биологически активных веществ (БАВ) – флавоноидов, витаминов, органических кислот, сахаров и др., что сильно завышает результаты определения. Метод Левенталя многие исследователи считают приблизительным, его можно использовать для полуколичественного определения, а также для предварительного знакомства с ЛРС. Кроме того, существующая НД на ЛРС скумпии кожевенной заметно устарела [2]. Таким образом, необходимо учитывать возможности физико-хиических методов анализа при разработке дополнений и изменений существующих НД на ЛРС, содержащее ДВ.

Цель настоящей работы – разработка методики количественного определения дубильных веществ методом спектрофотометрии в листьях скумпии кожевенной, а также сравнительный анализ перманганатометрического определения по сравнению со спектрофотометрическим.

Материал и методы

Объектом исследования служили высушенные образцы сырья листьев скумпии кожевенной, заготовленные в 2014 году в фазу цветения растения на юго-восточном склоне горы Машук в городе Пятигорске Ставропольского края. Масса аналитической пробы для анализа была отобрана в соответствии с ОФС 42-0013-03 «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб». Для извлечения суммы ДВ из ЛРС, согласно данным литературы, в качестве экстрагента чаще всего используют воду. Экспериментально установлены оптимальное соотношение ЛРС и экстрагента для извлечения ДВ – 2:250, а также наилучшее время экстракции, за которое будет извлекаться максимальное количество БАВ данной группы, – 30 мин (табл.1).

Таблица 1

Влияние соотношения «сырье-экстрагент» и времени экстракции на извлечение ДВ из листьев скумпии кожевенной

Соотношение «сырье –экстрагент», г/мл

Время экстракции, мин

Содержание ДВ*, %

2:200

20

23,23/25,47

2:250

25

29,41/27,70

2:300

30

21,47/29,16

2:400

35

16,47/28,01

2:500

40

14,62/26,74

*Примечание – через знак «/» приведены значения содержания дубильных веществ в зависимости от соотношения «сырье-экстрагент» и времени экстракции.

В стандартной методике ГФ XI указано, что извлечение фильтруют после охлаждения. Однако, согласно правилам изготовления извлечений из ЛРС, содержащего ДВ, фильтрование проводят в горячем виде. ДВ хорошо растворимы в горячей воде и плохо в холодной, что может привести к выпадению их в осадок при охлаждении извлечения. Поэтому было проведено сравнение содержания ДВ в извлечении при фильтровании в горячем виде и после полного охлаждения (табл. 2). Данные показывают, что фильтрование извлечения необходимо проводить в горячем виде.

Таблица 2

Содержание ДВ в зависимости от способа фильтрования*

Условия фильтрования

Содержание ДВ, %

Горячее извлечение

27,58

Охлажденное извлечение

23,02

*Примечание: в таблице представлено среднее значение 3-х определений.

Получение извлечения. Точную навеску сырья (около 2 г), измельченного и просеянного сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм, помещали в коническую колбу вместимостью 500 мл, заливали 250 мл кипящей воды очищенной и кипятили с обратным холодильником на электрической плите с закрытой спиралью в течение 30 минут при периодическом перемешивании. Полученное извлечение процеживали через вату, не дожидаясь охлаждения, так, чтобы частицы сырья не попали в мерную колбу вместимостью 250 мл. Объем раствора в колбе доводили до метки водой очищенной (раствор А).

Определение методом перманганатометрии. Аликвоту (раствор А) в количестве 25 мл переносили в коническую колбу вместимостью 750 мл, прибавляли 500 мл воды очищенной, 25 мл раствора индигосульфокислоты и титровали при постоянном перемешивании 0,02М раствором калия перманганата до золотисто-желтого окрашивания.

Параллельно проводили контрольный опыт.

Содержание дубильных веществ (Х,%) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляли по формуле:

Х% = ;

где – объемы титрованного раствора калия перманганата 0,02М, израсходованные на титрование в основном и контрольном опытах соответственно, мл;

– поправочный коэффициент титрованного раствора;

– титр 0,02М раствора калия перманганата по танину, г/мл;

– общий объем извлечения, полученный из взятой на анализ массы сырья, мл;

– масса навески сырья, взятая на анализ, г;

– аликвота извлечения, взятая для титрования, мл;

B – влажность сырья, %.

Согласно современным представлениям, истинное содержание ДВ можно определить методом спектрофотометрии, в основе которого лежит измерение оптической плотности водного извлечения из ЛРС, после взаимодействия с 2 % водным раствором аммония молибдата при длине волны 420±2 нм. Аналогичный максимум отмечен для раствора стандартного образца (СО) танина в воде (рис. 1). Это дало возможность использовать длину волны 420±2 нм в качестве аналитической для разработки методики количественного определения ДВ в сырье методом спектрофотометрии.

Методика определения дубильных веществ методом спектрофотометрии. Около 15 мл извлечения (раствор А) центрифугировали в течение 5 минут при 3000 об/мин. 5 мл центрифугата переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляли 10 мл 2 % водного раствора аммония молибдата и содержимое колбы доводили до метки водой очищенной. Через 15 минут измеряли оптическую плотность полученного раствора при длине волны 420 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из 5 мл центрифугата, доведенных водой очищенной до метки в мерной колбе вместимостью 100 мл.

На рисунке 1 приведены спектры поглощения растворов комплексов СО танина и извлечения из листьев скумпии кожевенной после реакции с аммония молибдатом.

Рис.1. Спектры поглощения растворов комплексов СО танина (1) и извлечения из листьев скумпии кожевенной (2) после реакции с аммония молибдатом

Содержание дубильных веществ (Х,%) в пересчете на танин и абсолютно сухое сырье рассчитывали по формуле:

,

где и – значения оптических плотностей растворов СО танина и анализируемого образца соответственно;

и – массы навесок СО танина и листьев скумпии кожевенной соответственно, г;

W0 и Wx – мерные колбы, использованные для разведения навесок СО танина и анализируемого образца соответственно, мл;

Va0 и Vax – аликвоты растворов СО и анализируемого образца соответственно, мл.

В – влажность сырья.

Приготовление СО танина: 0,1 г СО танина (точная навеска) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяли в воде очищенной, после чего содержимое колбы доводили до метки тем же растворителем (раствор Б). Аликвоту в количестве 6 мл переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 10 мл 2 % водного раствора аммония молибдата и содержимое колбы доводили до метки водой очищенной. Через 15 минут измеряли светопоглощение полученного раствора при длине волны 420 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из
6 мл раствора Б СО танина, доведенного водой очищенной до метки в мерной колбе вместимостью 100 мл.

Результаты исследований и их обсуждение

Результаты определения ДВ в листьях скумпии кожевенной с использованием различных методик представлены в таблице 3, статистическая обработка экспериментальных данных – в таблице 4.

Таблица 3

Содержание ДВ в листьях скумпии кожевенной, определенное различными методами

Метод

Содержание суммы ДВ*, %

Перманганатометрия

28,28±0,81

Спектрофотометрия

19,77±0,35

*Среднее значение 6 определений.

Таблица 4

Метрологическая характеристика методик определения дубильных веществ (p=95 %, n=6)

Xср

Sxср

Δx

Xср±Δx

ε, %

Перманганатометрия

28,275

0,3153

0,8104

28,28±0,81

2,86

Спектрофотометрия

19,77

0,1360

0,3495

19,77±0,35

1,77

Обе методики валидированы по показателям «линейность» и «правильность», а также была проведена внутрилабораторная воспроизводимость. Анализируя химизм реакций и химический состав листьев скумпии кожевенной, мы пришли к выводу, что метод спектрофотометрии более избирателен по сравнению с титриметрическим методом и отличается большей достоверностью. Таким образом, для изучаемого ЛРС – листья скумпии кожевенной, целесообразно включить в проект НД метод спектрофотометрии для определения суммы ДВ в пересчете на танин.

Выводы

1. Проведено количественное определение ДВ по методике ГФ XI для анализа листьев скумпии кожевенной. Установлены оптимальные параметры получения извлечения (соотношение сырья и экстрагента, время экстракции и фильтрация извлечения без охлаждения).

2. Разработана методика количественного определения дубильных веществ в листьях скумпии кожевенной методом спектрофотометрии в пересчете на танин.

3. Проведена сравнительная оценка определения ДВ в листьях скумпии кожевенной двумя методами: перманганатометрии и спектрофотометрии. По результатам исследования метод спектрофотометрии наиболее объективно отражает содержание ДВ в исследуемом сырье и рекомендован для включения в современную НД на данный вид сырья.

Рецензенты:

Коновалов Д.А., д.фарм.н., профессор кафедры фармакогнозии, зам. директора по НИР, Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, г. Пятигорск;

Кодониди И.П., д.фарм.н., доцент кафедры органической химии, Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, г. Пятигорск.