В связи с тем что в настоящее время исследованию жира и отдельных жирных кислот уделяется большое внимание, а также с развитием газовой хроматографии значительно интенсифицировались работы по изучению жирнокислотного состава липидов различных органов и тканей у высших животных и человека [4; 6; 7]. Роль жирных кислот достаточно хорошо изучена [2; 5]. Жирные кислоты обеспечивают транспорт и обмен одних из главных структурных компонентов клеточных мембран - фосфолипидов, участвуют в энергетическом обеспечении клеток, являются промежуточными продуктами в обмене аминокислот и углеводов, а также субстратами при синтезе клеточных медиаторов - простагландинов, тромбоксанов и лейкотриенов [3; 7].
Цель исследования - провести исследование жирнокислотного состава общих липидов (ЖКОЛ) крови, слюны и желчи коров и дать сравнительную оценку с соответствующими показателями у человека.
Материалы и методы
Объектами исследования явились коровы черно-пестрой породы. Слюну от крупного рогатого скота собирали из ротовой полости с помощью шприца в количестве 20 мл в течение 10 мин. К 20 мл собранной жидкости добавляли 3-кратный объем хлороформ-метанольной смеси (2:1, по объему). Затем встряхивали в течение 5 мин в делительной воронке объемом 200 мл. После разделения смеси липидный экстракт отделяли. Полученную хлороформ-метанольную вытяжку упаривали под вакуумом до объема 1-2 мл. К полученному объему добавляли 5-кратное количество 5%-ного раствора серной кислоты в метаноле и оставляли в термостате на 2 ч при 37 °С. Из охлажденной смеси (+20 °С) проводили реэкстракцию метиловых эфиров жирных кислот 3-кратным объемом гексана. Операцию повторяли трижды. Объединенные объемы гексана упаривали под вакуумом до 0,1 мл. Анализ жирных кислот в составе общих липидов слюны коров проводили методом газовой хроматографии [1]. Общие липиды крови и желчи (отобранной после убоя животных на мясокомбинате) выделяли хлороформ-метанольной смесью (2:1 по объему) из расчета 1 мл и 15 мл смеси, путем 3-разового (по 0,5) этапного экстрагирования. Подготовку проб для хроматографического анализа проводили аналогично как для слюны. Для разделения кислот применяли газовый хроматограф серии «Цвет-110» с ионизационно-пламенным детектором в стеклянных колонках размером 200×0,35 см, заполненных хроматоном N-AW-DMCS (0,125 - 0,160 мм) + 4.5% полидиэтиленгликольсукцината при следующих стандартных условиях анализа: температура испарителя 200 °С, термостата колонок 185 °С. Кроме того, применяли режим программирования температуры от 75 до 185 °С с интервалом 6 °С/мин. Поток газа носителя (азот особой чистоты) не превышал 30 мл/мин. Для построения калибровочных графиков анализировали характеристики каждой из кислот. Концентрацию кислот в смеси (%) определяли методом внутренней нормировки. Учет результатов: площади пиков на хроматограммах определяли с помощью измерительной лупы, умножая высоту пика на его ширину, измеренную в точке ½ высоты. Затем определяли долю каждого пика от общей площади всех пиков (в %), т.е. определяли содержание каждой кислоты (в %) от общего количества кислот.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0.
Результаты и их обсуждение
В крови, слюне и пузырной желчи коров, аналогично как в данных объектах человека, на хроматограммах определяются 23 жирные кислоты, в том числе 7 насыщенных, 5 моноеновых и 11 полиеновых. Доминирующими среди кислот крови и желчи являются 5 из них, составляющие в сумме более 80% (С16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 20:4), тогда как в слюне к 5 названным добавляется еще одна кислота - С20:5 - 5,8,11,14,17 - эйкозапентаеновая кислота (ЭПК).
Различия состава ЖКОЛ крови коров от такового у человека относится к 5 насыщенным (С14:0, 15:0, 18:0, 20:0, 22:0), одной моноеновой (С20:1) и 5 полиеновым (С18:2, 20:2, 20:5, 22:2) кислотам, уровни которых выше в спектре у человека, а также к 1 насыщенной (С16:0), 1 моноеновой (С16:1) и 3 полиеновым (18:3, 22:4, 22:6) кислотам, уровни которых выше у коров. Относительное равенство отмечено для 7 кислот: С17:0, 17:1, 18:1, 20:3, 20:4, 22:1, 22:3 (табл. 1). Сходные с кровью результаты отмечаются для показателей ЖКОЛ желчи коров и человека. Исключение составили уровни для С16:1, 17:0, 17:1, 18:1, 20:4, 20:5 кислот, т.е. 6 из 23 определяемых в равных количествах в данных сравниваемых группах кислот.
Таблица 1 - Жирнокислотный состав (в %) общих липидов биологических жидкостей
у коров и человека (M±m)
|
Жирные кислоты |
Желчь |
Кровь |
Слюна |
|||
|
Коровы (n=16) |
Человек (n=20) |
Коровы (n=16) |
Человек (n=23) |
Коровы (n=7) |
Человек (n=23) |
|
|
14:0 |
0.20±0.02 |
0.50±0.05* |
0.16±0.03 |
0.25±0.08* |
0.90±0.20 |
1.53±0.27* |
|
15:0 |
0.05±0.01 |
0.20±0.01* |
0.04±0.01 |
0.07±0.02* |
0.40±0.10 |
0.56±0.17 |
|
16:0 |
40.70±3.16 |
26.80±1.15* |
36.50±1.19 |
21.70±0.87* |
28.20±3.10 |
29.72±1.98 |
|
16:1 |
4.20±0.52 |
3.90±0.31 |
5.11±0.43 |
2.30±0.21* |
4.30±0.60 |
4.75±0.65 |
|
17:0 |
0.70±0.12 |
0.70±0.05 |
0.83±0.13 |
0.80±0.10 |
2.90±0.50 |
1.70±0.29 |
|
17:1 |
0.40±0.11 |
0.30±0.01 |
0.32±0.06 |
0.20±0.02 |
01.0±0.02 |
0.35±0.06 |
|
18:0 |
6.70±0.73 |
7.10±0.43 |
5.13±0.36 |
12.50±0.65* |
20.30±2.50 |
20.81±2.01 |
|
18:1 |
18.90±2.16 |
20.70±1.21 |
18.90±1.32 |
22.00±1.16 |
32.60±4.30 |
18.71±1.76* |
|
18:2 |
15.40±1.73 |
29.60±1.53* |
19.40±1.74 |
26.80±1.24* |
7.20±1.80 |
7.13±1.81 |
|
18:3 |
1.10±0.13 |
0.70±0.06* |
1.02±0.12 |
0.60±0.06* |
0.80±0.20 |
2.17±0.66* |
|
20:0 |
0.01±0.01 |
0.10±0.01* |
0.01±0.01 |
0.10±0.01* |
0.80±0.20 |
0.90±0.01 |
|
20:1 |
0.20±0.03 |
0.40±0.01* |
0.12±0.02 |
0.40±0.02* |
0.90±0.20 |
0.70±0.01 |
|
20:2 |
0.10±0.02 |
0.30±0.01* |
0.10±0.06 |
0.25±0.07* |
0.60±0.10 |
1.00±0.21 |
|
20:3 |
1.40±0.12 |
1.20±0.13 |
0.78±0.12 |
1.00±0.11 |
0.70±0.10 |
1.96±0.46* |
|
20:4 |
6.20±0.43 |
4.60±0.33 |
5.73±0.42 |
6.70±0.41 |
1.80±0.40 |
1.84±0.12 |
|
20:5 |
0.10±0.01 |
0.10±0.01 |
0.10±0.02 |
0.30±0.02* |
2.80±0.60 |
6.90±1.51* |
|
22:0 |
0.20±0.03 |
0.30±0.01* |
0.20±0.02 |
0.40±0.01* |
0.10±0.01 |
0.07±0.02 |
|
22:1 |
0.10±0.01 |
0.10±0.01 |
0.10±0.01 |
0.10±0.01 |
0.10±0.02 |
0.05±0.01 |
|
22:2 |
0.40±0.05 |
0.70±0.02* |
0.53±0.05 |
0.80±0.02* |
0.30±0.04 |
0.16±0.04 |
|
22:3 |
0.10±0.02 |
0.10±0.01 |
0.10±0.02 |
0.10±0.01 |
0.10±0.02 |
0.10±0.01 |
|
22:4 |
0.40±0.20 |
0.20±0.01* |
0.85±0.12 |
0.20±0.01* |
0.30±0.04 |
0.20±0.01 |
|
22:5 |
0.40±0.10 |
0.70±0.03* |
0.48±0.10 |
1.50±0.21* |
0.30±0.04 |
0.25±0.10 |
|
22:6 |
2.00±0.37 |
0.70±0.06* |
3.32±0.56 |
0.90±0.07* |
0.40±0.04 |
0.30±0.10 |
* p<0.05 - различие в группах.
В слюне у коров и человека определяются иные, специфические для нее, в отличие от крови и желчи, показатели ЖКОЛ. Так, отмечаются равные уровни для большинства - 17 из 23 - кислот. Различия относятся к С14:0, 18:3, 20:3, 20:5, количество которых у человека выше, и к С17:0и 18:1, уровни которых ниже по сравнению с данными в слюне коров.
Исходя из вышеизложенных результатов состава ЖКОЛ слюны наиболее важным и перспективным в отношении возможного выбора критерия оценки состояния липидного обмена и вероятной диагностики различных заболеваний у коров может служить показатель соотношения между полиеновыми С20:4 и С20:5 кислотами. Данное предположение связано с выявлением высокой концентрации С20:5 кислоты в липидах слюны в отличие от ее минимальных уровней в липидах крови и желчи как у человека, так и у коров.
Проведенный анализ жирных кислот в составе общих липидов крови, желчи и слюны у коров по сравнению с аналогичными объектами исследования у человека свидетельствует о том, что в крови и желчи сравниваемых субъектов имеются как однотипные, так и значительно различающиеся между собой показатели индивидуальных кислот. Естественно, что качественный состав всех трех объектов исследования оказался однотипен и нет эксклюзивных кислот, характерных для животных, относящихся к не млекопитающим. Преобладающими в объемном отношении определяются 5 кислот, являющихся основными, так называемыми центральными в обменных процессах липидов в целом (к данным кислотам стремится биосинтез большинства остальных кислот). Указанными однотипными данными сравнение ЖКОЛ по крови и желчи ограничивается. У коров, в отличие от человека, количественные показатели 19 из 23 кислот значительно различаются. Этот факт подтверждает различие метаболизма липидов у жвачных животных по сравнению с человеком, имеющих специфику в морфологических структурах желудочно-кишечного и гепатобилиарного трактов. В то же время как у коров, так и у человека нами определены равные уровни 17 из 23 жирных кислот в составе общих липидов слюны, т.е. в жидкости, секрете слюнных желез, которая является первой многокомпонентной средой, вступающей в контакт с пищей. При этом, как известно, жвачные животные удерживают пищу (жвачку) в этой среде значительно более длительное время по сравнению с человеком. Своеобразие переваривания пищи у коров, как известно, связано с задержанием корма в рубце на длительное время, куда непрерывно поступает слюна из ротовой полости. Можно предположить, что данная до настоящего времени мало изученная биологическая среда эволюционно сформировалась по своему составу у млекопитающих в определенной степени однотипно. Возможно, этим обусловливаются равные условия первого этапа сложного физиологического процесса пищеварения.
Заключение
Полученные результаты свидетельствуют о возможности проведения контроля за уровнем С20:5 кислоты методом газожидкостной хроматографии в качестве дополнительного диагностического критерия оценки процесса развития эндометрита. В то же время наши исследования требуют, очевидно, дальнейших фундаментальных изучений важного, на наш взгляд, объекта слюны - 5,8,11,14,17 - эйкозапентаеновой кислоты.
Рецензенты:
Бабичева И.А., д.б.н., профессор кафедры химии, ФГБОУ ВПО «Оренбургский ГАУ», г. Оренбург;
Герасименко В.В., д.б.н., профессор отделения химической технологии переработки нефти и газа и экологии, Филиал ФГБОУ ВПО «Российский государственный университет нефти и газа имени И.М. Губкина», г. Оренбург.