Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Хитозан [α (1-4) 2-амино 2-деокси β-D глюкан] является естественным линейным полисахаридом с гидрофильными свойствами, который получают из хитина. Хитин является основой экзоскелета членистоногих, но также обнаруживается у грибов [16]. Благодаря своим биологическим свойствам, таким как возможность биоразложения, актимикробная активность, инертность, высокая прочность, хитозан активно изучается для биомедицинского применения [13, 18, 19].

Катионные полимеры, содержащие несколько аминогрупп в своем скелете, могут быть использованы в качестве носителей ДНК для невирусной доставки генов: фосфатный скелет ДНК взаимодействует с аминогруппами хитозана при низких значениях рН что ведет к образованию комплекса ДНК-хитозан, в данном комплексе ДНК защищена от деградации нуклеазами и показывает большую эффективность трансфекции, чем нативная ДНК [7].

Альгинат является анионным полисахаридом с линейными цепями, которые состоят из α-L-глюкоуроновой и β-D-маннуроновой кислот. Важной особенностью альгината является способность к ионотропному гелеобразованию, которое позволяет инкапсулировать биоагенты, такие как белковые комплексы и клетки [14]. Легкая деградация, отсутствие токсичности, сорбционные способности делают альгинат удобным биополимером для приготовления нанокапсул [11].

Альгинат-хитозановые полиионные комплексы образуются благодаря ионотропному гелеобразования благодаря взаимодействию между карбоксильными группами альгината и аминогруппами хитозана. Получающийся комплекс биосовместим и легко подвергается биодеградации, а также защищает инкапсулированное вещество [24].

Декстран, как биосовместимый и легко разлагающийся полиионный полимер часто используется в качестве средства доставки лекарств [15]. Декстран-хитозановые наночастицы образуются за счет электростатического взаимодействия остовов хитозана и декстран сульфата [1]. Кроме того, сочетание декстран сульфата и хитозана в оптимальных соотношениях, для формулирования, может действовать синергически для включения, защиты и высвобождения терапевтических молекул [21].

Целью настоящей работы является разработка носителей ДНК на основе наночастиц, состоящих из хитозана, альгината и декстран сульфата, сравнение их физикохимических свойств, эффективности инкапсулирования ДНК, оценка цитотоксичности и эффективности трансфекции этих наночастиц. В данной работе впервые сообщается об использовании в качестве носителей ДНК наночастиц, содержащих хитозан, альгинат и декстран сульфат.

Материалы и методы

Материалы, штаммы бактерий, ДНК, культуры клеток использованные в данной работе и условия их культивирования.

Хитозан с низкой молекулярной массой (Mw=50 kDa, DD> 75%), натриевая соль декстран сульфата с молекулярной массой >500 kDa, альгинат натрия, 3-(4,5-диметилтиазол-2-)-2,5 - дифенил тетразолиум бромид (MTT) и хлорид кальция были произведены Sigma-Aldrich (США).

Штамм Escherichia coli Nova Blue(Novagen, США), содержащий вектор pEGFP-N2 (Invitrogene, США) выращивали в среде LB (Sigma-Aldrich, США), содержащей 100 мкг/мл ампицилина (ПанЭко, РФ) при 37ОС и интенсивной аэрации. Для приготовления всех трех типов наночастиц использовалась ДНК pEGFP-N2.

Трансфецирующий агент липофектамин - Lipofectamine^TM 2000 был приобретен в компании Invitrogen Inc. (США).

Для разведения наночастиц и липофектамина была использована среда DMEM (ПанЭко, РФ).

Линия эмбриональных клеток почек (HEK293) была получена из Altogen (США). Клетки HEK293 культивировали в свежей полноценной среде, которую готовили на основе DMEM с добавлением 10% об/об эмбриональной телячей сыворотки, 2mM L-глутамина, пенициллина (50 ед/мл) и стрептомицина (50 мкг/мл) (Life technologies Inc., Великобритания) при 37°C в увлажненной атмосфере с содержанием углекислого газа 5 % в инкубаторе Esco CelCulture CO2 incubater (Scimetrics Inc., США).

Клетки выращивали до конфлюента, после чего обрабатывали 0,25% раствором трипсина (Gibco, Великобритания) при 37°C в течение 5 минут (трипсинизация).

Выделение плазмидной ДНК

Для выделения ДНК использовали штамм Escherichia coli NovaBlue (Novagen, Германия) содержащий вектор pEGFP-N2. Выделение и очистку ДНК производили методом щелочного лизиса. Качество выделенной ДНК и степень очистки определяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле в буфере TBE. Количество ДНК и степень очистки препарата pEGFP-N2 определяли спектрофотометрически с помощью NanoDrop UV-Vis (Thermo Scientific, США).

Приготовление наночастиц с инкапсулированной ДНК

Для приготовления ДНК-содержащих наночастиц на основе альгината и хитозана использовали ДНК вектора pEGFP-N2. Оптимальными условиями были соотношение альгината к хитозану 1:1. Соотношение CaCl2/альгинат было 0.2% и соотношение N/P равнялось 5 при pH 5.3. [2]. Биополимерные наночастицы готовили, комбинируя процесс ионотропного гелеобразования и осаждения за счет взаимодействия между карбоксильными группами альгината и аминогруппами хитозана. Двухступенчатый процесс включает сшивку альгината натрия в присутствии хлорида кальция, затем альгинатная частица покрывается хитозаном для стабилизации. Для этого со скоростью 30 мл/ч 1мл разведенного раствора CaCl2 (0.00006%) добавляли по каплям через инсулиновую иглу к 3 мл альгината натрия, после чего была добавлена плазмидная ДНК также по каплям при постоянном перемешивании. В соответствии с соотношением компонентов 4 мл раствора хитозана были добавленны к смеси альгината, хлорида кальция и ДНК. Смесь перемешивали в течение 30 минут для окончания формирования наночастиц. После чего наночастицы были отделены от раствора центрифугированием при 20 000 об/мин в течение 20 минут. Процедура приготовления наночастиц с добавлением декстран сульфата была проведена в тех же условиях что и описанный выше процесс, различие заключалось в добавлении декстран сульфата до конечной концентрации 0.001% вес/объём в раствор альгината натрия. Хитозановые наночастицы с инкапсулированной ДНК были приготовлены методом комплексной коацервации [13].

Размер частиц, индекс полидисперсности и зета-потенциал

Определение размеров наночастиц было произведено с помощью динамического рассеяния света (ДРС) Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, Великобритания). Индекс полидисперсности (ИП) измеряли для каждого образца как индикатор разброса размеров частиц. Зета потенциал был определен с помощью Zetasizer Nano ZS по модели Смолуховского.

Оценка эффективности инкапсуляции ДНК

Эффективность инкапсуляции определяли как разницу между количеством ДНК, использованной для приготовления частиц и количеством ДНК оставшейся в супернатанте после осаждения наночастиц [13].

Оценка цитотоксического влияния наночастиц

Цитотоксичность наночастиц с инкапсулированной ДНК оценивали с помощью МТТ теста на цитотоксичность, согласно [5]. Относительную жизнеспособность (%) высчитывали на основе измерений при 555 нм и 700 нм в лунках планшета с помощью TECAN infinite® M200-PRO (Швейцария).

Жизнеспособность клеток в контрольном варианте опыта (клетки инкубированные в полноценной среде) принимали за 100%. Относительная жизнеспособность клеток высчитывали по формуле [жизнеспособные клетки] образец/ [жизнеспособные клетки] контроль × 100. Эксперимент был проделан в трех повторах.

Трансфекция in-vitro

Для проведения транфекции клетки HEK293 инокулировали в 500 мкл свежей полноценной среды в 24-луночный планшет (NunclonTM, Дания) при плотности 5×104 кл/лунку и выращивали в течение 24 часов при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2. После достижения 80% конфлюэнта клетки считали готовыми для трансфекции. После разведения наночастиц в DMEM наночастицы с содержанием ДНК 1 мкг вносили к клеткам и инкубировали еще 48 часов в тех же условиях. Клетки без добавления каких-либо веществ и клетки с добавлением чистой плазмидной ДНК (отрицательные контроли), так же комплекс Lipofectamine/ДНК (положительный контроль) инкубировали в тех же условиях, как и образцы с наночастицами.

Экспрессия EGFP была визуализирована с помощью флюоресцентного микроскопа Axio Observer S 100 (Zeiss, Германия). Все эксперименты были повторены трижды.

Результаты и обсуждение

Размер частиц, индекс полидисперсности и зета-потенциал

Средний размер частиц, распределение размеров частиц, ИП, зета потенциал и эффективность инкапсуляции для созданных наночастиц приведены в табл. 1. Данные приведены в виде средних значений (±стандартное отклонение) по результатам трех экспериментов.

Размер наночастиц является одна из важных характеристик, которая может влиять на эффективность трансфекции. Согласно данным, приведенным в табл. 1 средний гидродинамический диаметр для этих трех различных наночастиц составил от 147.3 нм до 196.3 нм. Наиболее компактными были наночастицы, состоящие из хитозана и альгината. Частицы, состоящие из альгината, декстран сульфата и хитозана были наиболее крупными. Введение альгината и декстран сульфата не обязательно приводит к увеличению размеров частиц, вероятно на размер больше влияет способ и условия приготовления частиц: ионотропное гелеобразование или комплексная коацервация.

Таблица 1

Размер частиц, распределение размеров, индекс полидисперсности (ИП), зета потенциал и эффективность инкапсуляции плазмидной ДНК в наночастицы разного состава

При этом размер наночастиц состава ДНК/хитозан/альгинат был меньше чем таковой у частиц ДНК/хитозан. Разница в размерах частиц объясняется образованием сшивок между ДНК и альгинатом с участием поливалентных катионов, таких как Ca2+, что приводит к образованию частиц меньшего размера, чем наночастицы состоящие из хитозана и ДНК [4]. В присутствии декстран сульфата средний размер частиц увеличивался, аналогично тому как сообщалось ранее [8]. Распределение размеров частиц характеризуется ИП, который является мерой гомогенности в дисперсной системе и может изменятся в интервале от 0 до 1. Гомогенность частиц в образце характеризуется значениями ИП близкими к нулю, тогда как ИП более 0,3 указывает на гетерогенность образца [27]. Как это видно из табл. 1 приготовленные наночастицы имели ИП меньше чем 0.2.

Зета потенциал наночастиц с инкапсулированной ДНК вариировал в пределах от 26.8 до 36.1 мВ (при pH 5.3). Позитивно заряженные частицы могут облегчить адгезию к клеточной мембране, индуцировать и увеличивать поглощение частиц клетками [5]. Кроме того, положительно заряженные частицы указывают, что в них ДНК полностью связана с хитозаном [10]. Было показано, что стабильность частиц выше, если зета-потенциал либо высоко негативен (<-30 mV) либо высоко позитивен (>+30 mV) [12], из чего можно сделать вывод, что стабильность наночастиц хитозан/ДНК была выше чем у наночастиц с включением других биополимеров. На это указывает, также, большая склонность наночастиц хитозан/альгинат и хитозан/альгинат-декстран сульфат к аггрегированию, чем это было отмечено для наночастиц, состоящих исключительно из хитозана.

Эффективность инкапсуляции (ЭИ)

Согласно табл. 1 ЭИ составляла от 83.07 до 94.71%. Присутствие декстран сульфата значительно увеличивало ЭИ. Увеличение ЭИ может происходить из-за усиления матрицы наночастицы по сравнению с частицами из хитозана или хитозана и альгината [20].

Цитотоксичность

Цитотоксичность наночастиц была определена с помощью МТТ теста. Нативная ДНК, ДНК с липофектамином были использованы в качестве контролей. Как видно из табл. 2, ни один из препаратов наночастиц не проявлял цитотоксичные свойства, тогда как только 60 % клеток выживали при обработке смесью липофектамин/ДНК. Более того, наночастицы увеличивали жизнеспособность клеток по сравнению с отрицательным контролем, где к клеткам была добавлена нативная векторная ДНК. Аналогичное повышение жизнеспособности наблюдалось при использовании наночастиц с альгинатом [20]. Частицы с декстраном показывали наибольшее увеличение жизнеспособности и это отличие было статистически достоверным.

Таблица 2

Жизнеспособность клеток и эффективность трансфекции

Трансфекция in-vitro

Для определения эффективности трансфекции частицы с инкапсулированной ДНК вектора pEGFP-N2 были инкубированы с клетками линии HEK 293 в качестве положительного контроля использовали векторную ДНК смешанную с липофектамином, который является эффективным препаратом для трансформации культур клеток для исследовательских целей.

Анализ флюоресценции трансфецированных клеток с помощью проточной цитофлуорометрии выявил, 55.39%, 38.49%, 35.04% и 16.67% клеток экспрессировали GFP при использовании липофектамина, наночастиц состава хитозан/альгинат-декстран сульфат, хитозан/альгинат и хитозан соответственно. Липофектамин, использованный в данном эксперименте в качестве положительного контроля.

Наиболее эффективными в трансформации были частицы размером 196.3 нм. Частицы, состоящие из хитозана размером 182 нм были наименее эффективны. Согласно ранее проведенным исследованиям частицы размером более 250 нм не отличаются по эффективности трансфекции [25]. Для частиц размером менее 250 нм было показано, что наночастицы с меньшим размером более эффективны для трансфекции ДНК [20, 23].

Вероятно, причина отсутствия данного тренда в наших исследованиях может быть объяснена разным составом наночастиц.

Частицы без добавления альгината или декстран сульфата были наименее эффективны в трансфекции. Большую эффективность наночастиц с применением альгината может объяснить увеличение эндосомального высвобождения: альгинат действует как протонная губка при разрушении [26]. Кроме того, гидрофильная природа хитозана препятствует высвобождению ДНК внутри клеток [6]. Большая трансфекционная эффективность наночастиц, содержащих декстран сульфат, может объясняться большим набуханием частиц [22], что ведет к более эффективному высвобождению плазмидной ДНК в клетках по сравнению с наночастицами состоящими из альгината и хитозана [20]. Кроме того, альгинат и декстран сульфат могут уменьшить электростатическое взаимодействие между хитозаном и ДНК, что также может способствовать высвобождению векторной молекулы.

Заключение

Наши исследования показали, что наночастицы на основе хитозана, альгината и декстран сульфата являются наиболее эффективными носителями для трансфекции ДНК. Кроме того в отличие от Липофектамина данные частицы не токсичны и даже усиливают пролиферацию и размножение клеток после трансформации. Полученные результаты позволяют рекомендовать данные композитные наночастицы в качестве носителей для трансфекции ДНК in vivo.

Рецензенты:

Багаева Т.В., д.б.н., заведующий кафедрой биотехнологии Казанского (Приволжского) федерального университета, г. Казань;

Гоголев Ю.В., д.б.н., заведующий лабораторией молекулярной биологии, ФГБУН "Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра" Российской академии наук, г. Казань.