В научной литературе имеются сведения о составе почвенных углеводородокисляющих бактериях, о трансформации микробных сообществ при загрязнении нефтью почв [2]. Наиболее активные естественные углеводородокисляющие бактериальные штаммы относятся к родам: Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus, Acinetobacter, Flavobacterium, Corynebacterium, Xanthomonas, Alcaligenes, Nocardia, Brevibacterium, Mycobacterium, Beijerinkia, Bacillus, Enterobacteriaceae, Klebsiella, Micrococcus, Sphaerotilus. Среди актиномицетов внимание привлекает многочисленный род Streptomyces [7]. В загрязненных почвах увеличивалась встречаемость фитотоксичных, фитопатогенных и потенциально патогенных для человека видов (Aspergillus fumigatus, A. niger, Trichodermaviride и др.) [6].
Изменение свойств почв и скорости деструкции при нефтяном загрязнении определяются не только дозой поллютанта, но и в значительной степени исходной микробиологической активностью почвы. В условиях подзоны южной тайги исследованы процессы деструкции нефти, изменение микробиологической и биохимической активности дерново-подзолистых почв при нефтезагрязнении [5]. Не все микроорганизмы, выделяемые из почв загрязненных нефтью, являются углеводородокисляющими. Определенные виды микроорганизмов окисляют углеводороды до промежуточных продуктов, последние могут служить источником питания для других групп микроорганизмов [8]. Как биосистема комплекс почвенных микроорганизмов динамичен; состав биоценозов, его структура изменяются не только в результате нефтяного загрязнения, но и непрерывно в ходе длительного и сложного процесса биологического разложения углеводородов [3].
Несмотря на множество работ по восстановлению почв, обилию созданных биопрепаратов, вне внимания исследователей осталась проблема ремедиации агродерново-карбонатных почв, подверженных загрязнению в районах нефтедобычи предуральского региона.
Методика полевых опытов. Мелкоделяночные полевые опыты проведены на территории опытного участка в Ильинском районе Пермского края. Объектом исследований были агродерново-карбонатные глинистые почвы, которые сформировались на пермских карбонатных породах. Эти почвы занимают 288 тыс. га, 1,8 % территории Пермского края; распахано 203 тыс. га дерново-карбонатных почв. Редкие почвы на пермских породах рекомендованы для включения в Красную книгу почв Пермского края [1].
Нефть из расчета 5, 10 и 20 л/м2 внесли в почву во второй половине мая 2007 г. Через неделю после загрязнения был внесен препарат «Альбит» в виде суспензии из расчета 50, 100 и 200 л/га (соответственно увеличению уровня загрязнения нефтью). Рыхление слоя 0-20 см проводили один раз в неделю в течение двух месяцев, одновременно поливали дозой 20 л/м2. Агрохимические свойства и остаточное количество нефти в почве определили через 70 дней после начала ремедиации. Отбор почвенных проб для учета численности микроорганизмов произведен через 7 дней после загрязнения и через 35, 70 дней после внесения ремедиантов.
Методы лабораторных исследований. Содержание углеводородов нефти определили методом жидкостной хроматографии (ГОСТ 13379-82), содержание углерода органических соединений – ГОСТ 23740-79. Для определения численности и таксономического состава комплекса углеводородокисляющих бактерий применяли метод посева на агаризированную глюкозо-пептонно-дрожжевую среду и среду Чапека с гексадеканом [4]. Посевы проводили стандартным способом из тысячного разведения в 5 кратной повторности после предварительной обработки на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-1 (22 кГц; 0,44 А; 2 мин).
Посевы инкубировали при комнатной температуре 3-7 суток, затем проводили подсчет и микроскопирование выросших колоний. Идентификацию микроорганизмов до рода проводили на основании изучения культуральных и микроморфологических признаков [9].
Результаты исследования и их обсуждение
Благодаря применению препарата «Альбит» за период около двух месяцев количество углеводородов в нефтезагрязненной почве снизилось на варианте 5 л/м2 нефти на 50 %, на варианте 10 л/м2 – на 40 %, на варианте 20 л/м2 – на 55 % относительно контрольного загрязненного варианта (рис. 1). Процесс деструкции нефти отражает также динамика содержания органического углерода.
Рис. 1. Количество общего органического углерода и углеводородов в нефтезагрязненной агродерново-карбонатной почве (после 70 дней ремедиации)
Биопрепарат «Альбит» не содержит живые клетки микроорганизмов, вероятно, его действие на нефтезагрязненную почву обусловлено активизацией аборигенной ассоциации микроорганизмов.
Установлена таксономическая структура и численность колониеобразующих единиц (КОЕ) сообщества углеводородокисляющих микроорганизмов в незагрязненной агродерново-карбонатной почве. Ассоциация бактерий включала следующие роды: Rhodococcus (108 КОЕ/г почвы) = Agrobactrium (108) >Bacillus (107) >Pseudomonas (106) = Clavibacter (106) >Xanthomonas (105). Через неделю после разлива нефти в микробоценозе агродерново-карбонатной почвы не обнаружены КОЕ бактерий родов Pseudomonas, Rhodococcus, Bacillus и Agrobactrium. Численность родов Clavibacter и Xanthomonas составила всего 102 КОЕ/г почвы (рис. 2,3,4).
Рис. 2. А - численность Pseudomonas (КОЕ/г почвы), Б -численность Rhodococcus(КОЕ/г почвы)в агродерново-карбонатной почве: 1 - через 7 дней после розлива, 2 - через 35 дней после начала ремедиации, 3 - через 70 дней после начала ремедиации;I - Нефть 5 л / м2, II - Нефть 5 л / м2 + «Альбит», III - Нефть 10 л / м2, IV -Нефть 10 л / м2 + «Альбит», V -Нефть 20 л / м2, VI -Нефть 20 л / м2 + «Альбит»
Через 35 дней с начала ремедиации в верхнем слое загрязненной почвы также присутствовали бактерии Clavibacter и Xanthomonas (рис. 3Б, рис. 4А), при меньшей дозе загрязнения (5 л/м2) появились Agrobactrium (104 КОЕ/г) (рис. 4Б) и Pseudomonas (102 КОЕ/г) (рис. 2А).
Рис. 3. А - численность Bacillus (КОЕ/г почвы), Б - численность Xanthomonas (КОЕ/г почвы) в агродерново-карбонатной почве: 1 - через 7 дней после розлива, 2 - через 35 дней после начала ремедиации, 3 - через 70 дней после начала ремедиации; I - Нефть 5 л / м2, II - Нефть 5 л / м2 + «Альбит», III - Нефть 10 л / м2, IV - Нефть 10 л / м2 + «Альбит», V -Нефть 20 л / м2, VI - Нефть 20 л / м2 + «Альбит»
Применение препарата «Альбит» существенно изменило структуру и численность бактериального сообщества. Через 35 дней ремедиации на его фоне в почве отмечены все характерные для незагрязненной почвы роды бактерий; с увеличением дозы загрязнения численность КОЕ, как правило, снижалась на 1-2 порядка. Усиление токсичности нефти не сказалось на Xanthomonas (рис. 3Б).
Через 70 дней в нефтезагрязненной почве присутствовали все группы микроорганизмов, но их численность не превышала 102 - 104 КОЕ/г почвы на вариантах без применения препарата. Под воздействием «Альбита» отмечены существенные изменения в ассоциации микроорганизмов. Численность бактерий на варианте с дозой нефти 5 л/м2возросла до 105-107 КОЕ/г почвы, была понижена на вариантах с дозой нефти 10 и 20 л/м2, соответственно 104-106 и 103-105 КОЕ/г почвы.
Рис. 4. А - численность Clavibacter КОЕ/г почвы), Б -численность Agrobacterium (КОЕ/г почвы) в агродерново-карбонатной почве: 1 - через 7 дней после розлива, 2 - через 35 дней после начала ремедиации, 3 - через 70 дней после начала ремедиации; I - Нефть 5 л / м2, II - Нефть 5 л / м2 + «Альбит», III - Нефть 10 л / м2, IV - Нефть 10 л / м2 + «Альбит», V - Нефть 20 л / м2, VI - Нефть 20 л / м2 + «Альбит»
Заключение. Опыты по ремедиации загрязненной нефтью агродерново-карбонатной почвы показали, что препарат «Альбит» активизирует аборигенную углеводородоокисляющую бактериальную флору и ускоряет процесс деструкции нефти. Ремедиация с применением биопрепарата рекомендуется для восстановления нефтезагрязненных почв, очистки почвогрунтов на территориях добычи нефти и складирования нефтепродуктов (нефтебазы, шламовые амбары и др.).
Рецензенты:
Ростова Н.Б., д.фарм.н., профессор, ГБОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Росздрава, г. Пермь;
Гейн В.Л., д.фарм.н., профессор, зав. кафедрой физколоидной химии, ГБОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Росздрава, г. Пермь.