Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,813

THE GEOGRAPHICAL AND SEASONAL VARIABILITY AMINO ACID COMPOSITION OF TISSUE FRESHWATER LEECH HAEMOPIS SANGUISUGA (L. 1758)

Chernaya L.V. 1
1 Institute of Plant and Animal Ecology Ural Branch of the Russian Academy of Sciences
Исследовано содержание свободных аминокислот в тканях пресноводной пиявки Haemopis sanguisuga (L., 1758) из водных экосистем различных климатогеографических зон и в разные сезоны года (весна, лето, осень). Обнаружено, что обитание пиявок в неблагоприятных климатических условиях сопровождается интенсификацией аминокислотного обмена и стабильно высоким уровнем паттерна незаменимых аминокислот в тканях. Показано, что наибольшее влияние на аминокислотный обмен пиявок H. sanguisuga оказывает осеннее понижение температуры. В тканях пиявок, уходящих в зимний анабиоз, наблюдается аминокислотный дисбаланс, что указывает на высокую экологическую пластичность их метаболических процессов. Установлено, что повышение суммарных концентраций свободных аминокислот в тканях является адаптивным механизмом пиявок H. sanguisuga к воздействию неблагоприятных факторов среды.
The content of free amino acids in the tissues of freshwater leeches Haemopis sanguisuga (L., 1758) of the aquatic ecosystems of different climatic zones and different seasons (spring, summer, autumn) were studied. Found that dwelling leeches in adverse weather conditions is accompanied by an intensification of amino acid metabolism and consistently high level pattern of essential amino acids in the tissues. It is shown that the greatest influence on the amino acid exchange leeches H. sanguisuga has autumn drop in temperature. In the tissues of leeches, going in winter hibernation, there is an amino acid imbalance, which indicates a high ecological plasticity of their metabolic processes. Found that an increase in the total concentration of free amino acids in the tissues is an adaptive mechanism leeches H. sanguisuga to adverse environmental factors.
seasons of the year
adverse climatic conditions
adaptation
free amino acids
Leeches
Температура окружающей среды является важнейшим фактором, влияющим на распространение, численность и физиологическое состояние животных. Большая ложноконская пиявка Haemopis sanguisuga (L., 1758) широко распространена и особенно многочисленна в водных экосистемах юга европейской части России и сопредельных государств [1,5, 7]. На территории Европейского Севера, Урала и Сибири этот вид пиявок становится редким и малочисленным компонентом гирудофауны, что обусловлено экстремальными условиями для ее размножения в условиях сурового климата (короткий безморозный период, глубокое промерзание грунта) [2, 4, 6, 8]. Поскольку большие ложноконские пиявки имеют многолетний жизненный цикл (пять и более лет), они при наступлении зимних холодов неоднократно впадают в длительный зимний анабиоз.  С этих позиций несомненна актуальность исследований, направленных на изучение адаптивных возможностей пиявок к неблагоприятным факторам среды. Известно, что одной из форм физиологической адаптации пойкилотермных животных к обитанию в условиях низких температур является накопление в тканях и жидкостях биологически активных соединений: низкомолекулярных спиртов, свободных углеводов и аминокислот [3, 9]. Данное исследование посвящено изучению географических и сезонных особенностей аминокислотного спектра тканей хищной пиявки H. sanguisuga.

Материалы и методы

В исследованиях было использовано 140 взрослых особей большой ложноконской пиявки H. sanguisuga. Для изучения географических особенностей аминокислотного обмена использованы пиявки из 11-ти водных объектов различных регионов России, Украины и Казахстана: оз. Горелое и р. Уды (Харьковская обл.), оз. Глубокое (Луганская обл.), р. Лесной Воронеж (Тамбовская обл.), ерик Судомойка (Волгоградская обл.), р. Челбас (Краснодарский край), р. Бобровка и р. Сысерть (Свердловская обл.), оз. Еловое (Челябинская обл.), р. Нура и оз. Боровое (Акмолинская обл.). При сравнительной оценке аминокислотного спектра тканей пиявок, обитающих в водных экосистемах различных природно-климатических зон, использовали условные термины: европейская форма H. sanguisuga (регионы восточной части Украины и европейской территории России, где среднегодовая температура находится в диапазоне от +6.1єС до +11.9єС) и азиатская форма (Урал и северная часть Казахстана - регионы со среднегодовой температурой от +2.3єС до +3.2єС). Сезонную динамику концентраций свободных аминокислот (АК) в тканях пиявок оценивали у особей, отловленных в разные сезоны года в Белоярском водохранилище (Свердловская обл.): весной (I-я декада мая), летом (I-я декада августа) и осенью (III-я декада октября). Содержание пиявок, доставленных в лабораторию, осуществляли в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и научных целей [1].

Пул свободных аминокислот в тканях пиявок определяли методом ионообменной хроматографии с помощью автоматического анализатора ААА-339М фирмы Mikrotechna (Chechia). Подготовлено 140 проб, проведено 3220 элементо-определений.

Экспериментальные данные обрабатывали с использованием пакета лицензионных прикладных программ «Statistica for Windows 6.0.». Различия между сравниваемыми выборками считали статистически значимыми при p < 0.05; p < 0.01 - 0.001.

Результаты и обсуждение

Показано, что независимо от региона исследования, качественный состав аминокислотного спектра тканей H. sanguisuga постоянен, а его количественная структура претерпевает существенные изменения (табл.).

У европейской формы пиявок суммарный фонд свободных АК в тканях подвержен географической изменчивости (p < 0.001). Наибольшая дисперсия характерна для тканевых концентраций глутаминовой кислоты, пролина, аланина, цистеина, γ-аминомасляной кислоты, гистидина и аргинина (p = 0.000); наименьшая изменчивость выявлена для содержания фенилаланина (p = 0.020) (табл.).

У особей азиатской формы H. sanguisuga, в отличие от европейских пиявок, не выявлено географической изменчивости, как для суммарного фонда АК, так и для паттернов незаменимых (НАК) и заменимых (ЗАК) аминокислот (p > 0.05) (табл.). Уровень содержания аланина и валина, которым принадлежит ключевая роль в энергетическом гомеостазе и синтезе глюкозы, в тканях азиатской формы большой ложноконской пиявки, как показал дисперсионный анализ, подвержен наименьшей изменчивости (p = 0.001). Для концентраций остальных свободных АК, содержащихся в тканях пиявок азиатских популяций, выявлена достаточно высокая дисперсия (p < 0.000). Наибольшей внутривидовой изменчивости подвержены тканевые концентрации цистеиновой кислоты, пролина, цистеина, метионина, γ-аминомасляной кислоты, аргинина (p = 0.000) (табл.).

Диапазоны процентного содержания свободных аминокислот (min-max) и дисперсия их концентраций (Н-критерий Краскела - Уоллеса) в тканях H. sanguisuga различных географических популяций

 

АК, %

 

H. sanguisuga

Европейская форма

n = 60

Азиатская форма

n = 50

min-max

H5; 60

p

min-max

H4; 50

p

Cysteic Acid

Aspartic Acid

Threonine

Serine

Glutamic Acid + Gln

Proline

Glycine

Alanine

Valine

Cystine

Methionine

Isoleucine

Leucine

Tyrosine

Phenylalanine

GAВA

Ornithine

Lysine

Histidine

Arginine

0.56 - 1.33

5.93 - 10.7

3.51 - 5.89

4.55 - 8.36

24.6 - 29.3

0.66 - 3.55

6.29 - 7.94

14.1 - 19.4

5.87 - 7.19

0.21 - 1.08

0.94 - 1.80

1.74 - 3.56

2.60 - 6.01

0.84 - 1.92

1.56 - 2.66

0.32 - 0.94

1.2 - 2.26

2.74 - 5.55

0.39 - 1.48

0.30 - 0.89

48.8

42.4

36.2

49.6

54.0

51.1

37.0

52.8

46.1

50.7

26.8

45.2

32.9

30.1

13.4

51.0

38.7

46.3

50.8

55.8

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.020

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.56 - 2.59

8.17 - 14.3

4.28 - 6.68

5.05 - 6.75

17.1 - 25.5

0.30 - 0.72

6.15 - 8.43

14.6 - 17.9

5.47 - 7.70

0.31 - 0.67

1.77 - 3.83

2.47 - 3.47

4.16 - 5.88

1.40 - 2.19

1.79 - 2.69

0.13 - 0.87

1.24 - 2.52

3.95 - 5.72

1.21 - 2.15

0.68 - 1.72

40.1

37.9

22.1

20.3

25.1

43.5

26.3

18.7

18.7

44.1

42.7

20.9

33.0

22.6

25.4

45.5

35.9

33.2

35.9

43.0

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.001

0.001

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

Фонд АК, мкмоль/100г

НАК

ЗАК

1512 - 2311

23.5 - 30.3

66.1 - 72.7

34.9

22.2

46.3

0.000

0.005

0.000

2112 - 2559

31.5 - 33.6

63.0 - 66.0

7.42

7.42

6.29

0.115

0.115

0.178

Основным критерием аминокислотного баланса в организме являются показатели антитоксического индекса Фишера (ИФ) - соотношение концентраций аминокислот с разветвленной углеродной цепью (валин, изолейцин, лейцин) к ароматическим АК (тирозин, фенилаланин), составляющее в норме 0.3 ± 0.5. По нашим данным, значения ИФ у европейской формы пиявок лежат в диапазоне 3.23-4.43, а азиатской - от 3.22 до 3.94, что несколько отклонено от нормы, но не критично, и связано, скорее всего, с экологическими особенностями мест обитания.

Сравнительный анализ показал, что у особей H. sanguisuga, обитающих в водных экосистемах Урала и Северного Казахстана, по сравнению европейскими особями, более высокий уровень суммарных концентраций свободных АК тканей (p < 0.05) (табл.). В тканях азиатских пиявок повышено процентное содержание цистеиновой кислоты, аспарагиновой кислоты, треонина, глицина, метионина, тирозина, гистидина и аргинина, но понижено - серина, глутамата и глутамина, пролина, аланина и цистеина. Обнаружено, что обитание пиявок в условиях короткого безморозного периода и холодной продолжительной зимы сопровождается значительным повышением пула НАК.

Установлено, что физиологические процессы, связанные с сезонными особенностями биологического цикла гирудинид, обусловливают качественные и количественные изменения аминокислотного спектра в их тканях. Суммарные концентрации свободных АК в тканях H.sanguisuga значимо изменяются по сезонам: осень > весна > лето (p < 0.05) (рис.).

Сезонная динамика концентраций основных метаболических групп аминокислот в тканях больших ложноконских пиявок

Дисперсионный анализ выявил очень высокую сезонную изменчивость аминокислотного фонда ложноконской пиявки (H2; 30 = 26.7; p = 0.000). Максимальные концентрации свободных АК  (3058.6 ± 139.3 мкмоль/100 г) выявлены в тканях осенних особей (p < 0.05) (рис.). Аминокислотный пул, уходящих в анабиоз пиявок, повышен за счет кратного роста концентраций цистеиновой кислоты, глутаминовой кислоты и глутамина. Наиболее примечательными отличиями этой сезонной группы пиявок являются полная утилизация пролина, метионина и γ-аминомасляной кислоты, и присутствие в их тканях цитруллина и незаменимой аминокислоты триптофана, которые в летних и весенних биопробах H. sanguisuga не выявлялись.

У весенних пиявок, вышедших из зимнего анабиоза, суммарный фонд АК в тканях по сравнению с осенними особями снижен в 1.2 раза (2570.1 ± 222.9 мкмоль/100г) (p < 0.05) (рис.). Аминокислотный пул весенних пиявок за зимний сезон полностью утилизировал цитруллин и триптофан, а также потерял существенные количества цистеиновой кислоты и глутаминовой кислоты и глутамина, их содержание снизилось в 4.6 и 4.7 раза соответственно, однако концентрации остальных АК значимо повысились, что обусловлено активацией обменных процессов H. sanguisuga (p < 0.05).

Летний период, наиболее благоприятный в биологическом цикле гирудинид, когда происходит интенсивное наращивание мышечной массы и основная репродуктивная деятельность, характеризуется пониженным уровнем аминокислотного обмена H. sanguisuga. Суммарные концентрации АК в тканях летних особей (927.6 ± 73.4 мкмоль/100г)  ниже, чем у весенних и осенних пиявок в 2.8 и в 3.3 раза соответственно (p < 0.01) (рис.). В тканях этой сезонной группы H. sanguisuga отмечены минимальные концентрации всех свободных АК, за исключением пролина, участвующего в синтезе коллагена (p < 0.05). Наибольший обвал концентраций свободных АК в тканях летних особей, по сравнению с весенними, отмечен для цистеиновой кислоты, аспарагиновой кислоты, цистеина и для незаменимых АК: треонина, валина, метионина, изолейцина, лейцина, гистидина и аргинина (p < 0.01).

Отмечено, что суммарные концентрации пула незаменимых АК пиявок достаточно высоки и убывают в ряду весна < осень ≤ лето (рис.). В то же время низкий показатель соотношения НАК/ЗАК у осенних особей H. sanguisuga (0.10) указывает на аминокислотный дисбаланс в их тканях. О том, что у пиявок, уходящих в анабиоз, нарушен азотистый обмен, свидетельствует и высокое значение антитоксического индекса Фишера (ИФ=8.26). Пул заменимых АК в тканях осенних особей H. sanguisuga составляет 82.2 % от суммарного фонда, при этом на долю глутаминовой кислоты и глутамина приходится 67.0 %. Глутаминовая кислота поддерживает энергетический, медиаторный и пластический обмены в организме. Она служит предшественником при синтезе белков, ряда биологически активных соединений, обеспечивает синтез заменимых АК. При стрессовом напряжении организма (в нашем случае - околонулевая температура воды) глутамат служит естественным поставщиком кетоглутарата и янтарной кислоты, являясь наиболее эффективным субстратом в энергообеспечении. У особей ложноконских пиявок других сезонных групп глутаминовая кислота содержится в гораздо меньшем количестве: у летних особей - 23.6 %, у весенних - 17.0 % от суммарного фонда АК. Таким образом, выявленный нами высокий уровень глутамата в тканях осенних пиявок является необходимым метаболическим условием для поддержания процессов жизнеобеспечения H. sanguisuga, переходящих в зимний продолжительный анабиоз.

Заключение. Проведенные исследования установили общую закономерность внутривидовой изменчивости тканевого содержания пролина, цистеина, γ-аминомасляной кислоты и аргинина у обеих географических форм H. sanguisuga, что указывает на регулирующую роль данных АК в адаптации пиявок к экологическим особенностям изучаемых регионов. Обитание больших ложноконских пиявок в экстремальных климатических условиях сопровождается интенсификацией аминокислотного обмена и стабильно высокими концентрациями паттерна незаменимых аминокислот в тканях. Исследования сезонной изменчивости аминокислотного спектра в тканях пиявок H. sanguisuga показали, что наибольшее влияние на обменные процессы гирудинид оказывает осеннее понижение температуры. Высокая степень аминокислотного дисбаланса в тканях пиявок, уходящих в зимний анабиоз, по-нашему мнению, может способствовать развитию экологической пластичности метаболических процессов и выживанию не только в период зимнего анабиоза, но и формированию адаптивных стратегий при влиянии экстремальных факторов различного генеза.

Исследования проведены при поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», грант №12-П-4-1049.

Рецензенты:

Хохуткин И.М., д.б.н., ведущий научный сотрудник Института экологии растений и животных, Уральское отделение Российской Академии наук, г. Екатеринбург;

Ковальчук Л.А., д.б.н., ведущий научный сотрудник Института экологии растений и животных, Уральское отделение Российской Академии наук, г. Екатеринбург.