Одной из актуальных проблем ветеринарной науки и практики остаетъся проблема повышения плодовитости свиноматок. Ее решение сдерживается из-за широкого распространения среди маточного поголовья болезней репродуктивных органов, из которых особое место занимают неспецифические заболевания матки, развивающиеся в послеродовой период. Нередко эти заболевания принимают массовое распространение и приводят к бесплодию. В связи с этим не случайно терапии и профилактике послеродовых заболеваний уделяется большое внимание. Однако лечение и профилактика могут быть успешными только в том случае, если раскрыт патогенез заболевания, детально изучены морфологические, иммунологические, биохимические и другие изменения в организме сопровождающие болезнь.
Известно, что в воспалительный процесс вовлекаются многие биохимические компоненты, среди которых особую значимость представляют ферментные системы. Усовершенствование и разработка новых методических подходов к обнаружению ферментов и определению их активности позволили расширить представления о роли этих веществ в функционировании органов и тканей, а также в развитии патологических состояний в организме животных [10, 11, 8].
В то же время сведения об активности ферментов в органах репродуктивной системы свиноматок не многочисленны и зачастую носят противоречивый характер. Это, в свою очередь, приводит к недооценке роли ферментов в патогенезе заболеваний половых органов и неправильному подходу к лечению.
Принимая во внимание актуальность и научно-практическую значимость указанной проблемы, целью настоящей работы являлось определение активности протеолитических ферментов, аминотрансфераз и фосфатаз эндометрия свиноматок в зависимости от стадии полового цикла, а так же развития осторого воспаления.
Материалом для исследований являлись матки свиноматок крупной белой породы здоровых и больных острым послеродовым эндометритом, которые отбирали непосредственно после убоя. Животные подбирались по принципу аналогов с учетом возраста, массы тела, стадии полового цикла, условий содержания и кормления, а также характера воспалительного процесса.
Стадии полового цикла определяли по внешнему состоянию яичников (наличию и величине фолликулов и желтых тел), а также на основании гистологических исследований эндометрия. При постановке диагноза заболевания учитывали анамнез, результаты клинического обследования, гематологического анализа, данные визуальной оценки общего состояния матки и ее слизистой оболочки.
Для исследований отбирали навески эндометрия массой по 10 г путем среза из различных участков рогов матки: в области 1-й, 2-й, и 3-й трети рогов. Маточную слизь собирали соскобом с поверхности эндометрия.
Определение активности ферментов проводили в гомогенате из эндометрия и внутриматочной слизи. Эндометрий получали механическим путем из разных участков рогов матки (1-, 2- и 3-я трети. Навески массой 10г гомогенизировали в 50 мМ трис-НС1 буфере, рН 7,4 при 12000 об в мин в течении 5 минут. Маточную слизь собирали соскобом с поверхности эндометрия.
Определение активности протеолитических ферментов в гомогенате и субклеточных фракциях проводили методом Ансона [12]. При этом активность ферментов определяли по приросту тирозина, который измеряли спектофотометрически, и выражали в мкм тирозина/мг белка/мин.
Концентрацию белка в гомогенате и субклеточных фракциях проводили методом Варбурга и Кристиана [4].
Активность аминотрансфераз (АСТ, АЛТ) в гомогенате определяли методом Райтмана-Френкеля [5], выражали её в моль/мг белка/мин.
Щелочную фосфатазу (ЩФ) и кислую фосфатазу (КФ) устанавливали методом Бодански, [7, 9] обозначали её в моль/мг белка/мин.
Полученные в ходе исследований данные подвергались биометрической обработке на ПЭВМ с использованием пакета прикладных программ [1, 2, 3, 6].
В ходе проведенных исследований было установлено, что в период стадии возбуждения полового цикла активность кислых протеаз была достоверно выше, чем в стадии уравновешивания, и ниже, чем в стадии торможения. При этом наибольшая активность была выявлена во 2-й трети рогов матки (3,61±0,08 мкмоль тирозина/мг белка/мин), а наименьшая - в 1-й трети (2,86±0,04).
В стадии торможения регистрировалась максимальная активность кислых протеаз, которая наиболее выраженной отмечалась во 2-й трети рогов матки (4,20±0,09). В то же время показатель активности этих ферментов в маточной слизи (3,29±0,08 мкмоль тирозина/мг белка/мин) не имел достоверных отличий от такового, полученного в период стадии возбуждения (3,24±0,08 мкмоль тирозина/мг белка/мин).
В период стадии уравновешивания активность протеолитических ферментов в тканях всех участков матки колебалась в границах от 1,61±0,07 до 2,14±0,04 мкмоль тирозина/мг белка/мин. При этом наименьшее ее значение регистрировалось в тканях 1-й трети рогов матки, а максимальная - во 2-й трети рогов матки. Что касается исследуемых ферментов в маточной слизи, то в период стадии уравновешивания она была максимальной (4,38±0,06 мкмоль тирозина/мг белка/мин) по сравнению с другими стадиями полового цикла. Увеличение протеолитической активности маточной слизи в стадии уравновешивания, повидимому, связано с вакуолярной дегенерацией клеток и выходом ферментов во внеклеточную среду.
Наибольшая активность кислых протеаз, не зависимо от стадии полового цикла, отмечалась во 2-й трети рогов матки, что можно объяснить развитой сетью артерий и большим количеством маточных желез в этой части эндометрия.
Результаты определения активности щелочной фосфатазы показали, что в период стадии возбуждения полового цикла она была достоверно выше, чем в стадии уравновешивания, и ниже, чем в стадии торможения. Так, в 1-й трети рогов матки активность этого фермента составляла 25,4±1,40 ммоль/мг белка/мин, что достоверно выше, чем во 2-й трети - (15,2±0,98 ммоль/мг белка/мин), и не имела отличий от 3-й трети -(22,3±1,59 ммоль/мг белка/мин.). Что касается активности ЩФ в маточной слизи, то в стадии возбуждения она была меньше (9,5±0,17 ммоль/мг белка/мин), чем в период других стадий (12,7±0,52 - 24,4±1,14 ммоль/мг белка/мин).
Во время стадии торможения активность ЩФ была достоверно выше (р<0,05-0,01), чем в период других стадий и колебалась в пределах от 41,72±3,52 до 49,88±3,38 ммоль/мг белка/мин. В зависимости от локализации в рогах матки достоверных отличий в активности этого фермента выявлено не было. Активность ЩФ в маточной слизи во время этой стадии имела наиболее высокой показатель 24,4±1,14 ммоль/мг белка в мин).
Активность ЩФ в стадии уравновешивания полового цикла была относительно низкой. Так, в 1-й трети рогов матки она составляла 11,04±0,46, во 2-й трети - 9,7±0,25 и в 3-й трети - 9,57±0,18 ммоль/мг белка/мин. При этом разность между установленными показателями была недостоверной (Р>0,05). В маточной слизи активность данного фермента в стадии уравновешивания была выше, чем в стадии возбуждения (12,70±0,52 ммоль/мг белка/мин).
При исследований активности общей кислой фосфатазы нами было установлено, что во время стадии возбуждения в 1-й трети рогов матки активность этого фермента была достоверно ниже (р<0,05), чем в других участках, и составляла 13,12±0,41 ммоль/мг белка/мин. Во 2-й (17,30±0,69) и в 3-й третях рогов матки (18,34±0,71 ммоль/мг белка/мин) достоверных отличий между выявленными показателями активности обнаружено не было. Активность общей КФ в маточной слизи в стадии возбуждения полового цикла имела наименьшее значение (15,62±0,98 71 ммоль/мг белка/мин) по сравнению с другими стадиями.
Активность общей КФ в стадии торможения была относительно высокий. В 1-й трети рогов матки она составляла 20,60±0,90, во 2-й трети -22,20±0,81 и в 3-й трети - 18,41±0,81 ммоль/мг белка/мин. В маточной слизи активность общей КФ в стадии торможения не имела достоверных отличий (р>0,05) от стадии возбуждения и составляла 17,47±1,21 ммоль/мг белка/мин.
В стадии уравновешивания полового цикла активность общей КФ в 1-й трети рогов матки была достоверно ниже (13,24±0,61), во 2-й трети выше (22,46±0,80), а в 3-й трети (18,41±0,81 ммоль/мг белка/мин) она не имела достоверных отличий по сравнению с аналогичными показателями во время стадии торможения. Активность общей КФ в маточной слизи в стадии уравновешивания была достоверно выше (21,58±0,89 ммоль/мг белка/мин), чем в других стадиях.
При определении ферментативной активности простатической кислой фосфатазы в различных участках эндометрия в зависимости от стадии полового цикла было установлено, что во время стадии возбуждения наибольшая активность простатической КФ наблюдалась во 2-й трети рогов матки (4,1±0,2 ммоль/мг белка/мин). При этом в маточной слизи активность этого фермента в стадии возбуждения имела низкие значения по сравнению с другими стадиями полового цикла и составляла 4,7±0,3 ммоль/мг белка/мин.
Активность простатической КФ в стадии торможения была относительно высокой. Так, в 1-й трети рогов матки она составляла 10,6±0,2 во 2-й трети - 13,3±0,4 и в 3-й трети - 6,9±0,2 ммоль/мг белка/мин. Активность простатической КФ маточной слизи (5,5±0,3 ммоль/мг белка/мин) в этой стадии не имела достоверного различия (р>0,05) от стадии возбуждения.
В стадии уравновешивания было установлено, что активность простатической КФ в 1-й (5,5±0,2), во 2-й (6,9±0,2) и в 3-й третях рогов матки (7,1±0,2 ммоль/мг белка в мин) была достоверно (р<0,05) ниже, чем в стадии торможения. Что касается маточной слизи, то активность протатической КФ в стадии, уравновешивания, была выше (7,0±0,2), чем в другие стадии.
Результаты исследований АЛТ и АСТ показал и, что активность данных ферментов зависит от места локализации в рогах матки и стадии полового цикла.
В тканях эндометрия стадии возбуждения активность АСТ и АЛТ была наибольшей и соответственно составляла в 1-й трети рогов матки - 5,7±0,2 и 5,4±0,2; во 2-й трети - 5,8±0,2 и 6,4±0,1 и в 3-й трети -4,4±0,1 и 6,4±0,2 ммоль/мг белка в мин. В маточной слизи активности АСТ имела наименьшее значение (4,4±0,1.,а АЛТ (3,2±0,2ммоль/мг белка в мин), наоборот, была достоверно выше (р<0,05), чем в стадии уравновешивания.
Высокий активность аминотрасфераз в стадии возбуждения полового цикла, по-видимому, связана с пролиферативными процессами и усиленной секреторной активностью маточных желез, которые сопровождаются активацией биосинтеза белков и аминокислот при участии аминотрансфераз.
Активность АСТ в стадии торможения по сравнению с соответствующим показателем в стадии возбуждения была ниже в 1-й трети рогов матки (3,85±0,06 ммоль/мг белка/мин), чем во 2-й (5,82±0,17) и 3-й третях (4,44±0,14 ммоль/мг белка/мин). В маточной слизи активность АСТ в период стадии торможения составляла 3,34±0,18 ммоль/мг белка/мин, что не имело достоверных отличий от её активности в другие стадии полового цикла (3,22±0,17-4,48±0,11 ммоль/мг белка/мин).
Уровень активности АЛТ в стадии торможения полового цикла был достоверно ниже во всех участках рогов матки по сравнению с аналогичным показателем в стадии возбуждения. При этом в зависимости от локализации в матке его максимальный уровень отмечался во 2-й трети рога (5,6±0,1 ммоль/мг белка/мин). Активность АЛТ в маточной слизи в стадии торможения имела наибольшие значение (5,4±0,1) по сравнению с соответствующими показателем в другие стадии полового цикла (3,85±0,09-4,40±0,14 ммоль/мг белка/мин).
При определении активность АСТ в стадии уравновешивания она была выше во 2-й и в 3-й третях рогов матки (4,59±0,13-4,79±0,15 ммоль/мг белка/мин), а в 1-й трети ниже (4,34±0,11) по сравнению с аналогичными показателем в стадии торможения полового цикла. В маточной слизи в период стадии уравновешивания активность АСТ имела более высокое значение (4,48±0,11), чем в другие стадии полового цикла (3,22±0,17-3,34±0,18 ммоль/мг белка/мин).
Активность АЛТ в стадии уравновешивания полового цикла не имела достоверных отличий в 1-й и 2-й третях рогов матки и колебалась в пределах 4,65±0,15-5,34±0,17, а в 3-й трети была выше (4,77±0,17), чем соответствующий показатель в стадии торможения 3,72±0,13 ммоль/мг белка/мин). В маточной слизи активность этого фермента имела наименьшее значение и составляла 3,85±0,09 ммоль/мг белка/мин.
В ходе определения ферментов слизистой оболочки матки при остром послеродовом серозно-катаральном эндометрите у свиноматок были выявлены характерные изменения. Так, активность кислых протеаз при остром эндометрите у свиноматок достоверно повышалась (р<0,05). Наиболее выраженное повышение этого показателя отмечалось во 2-й трети рогов матки, где он составлял 5,90±0,17 мкмоль тирозина/мг белка/мин.
Что касается кислых фосфатаз, то при остром эндометрите достоверно (р<0,05) повышается активность общей и простатической КФ во всех участках рогов матки по сравнению с аналогичным показателем у здоровых животных. Так, отмечено увеличение активности этого фермента в 1-й трети рогов матки - в 9 раз, во 2-й - в 11 раз и в 3-й - в 6 раз. Активность простатической формы КФ при эндометрите увеличивалась в 1-й трети рогом матки в 8,4 раза, во 2-й - в 15 раз и в 3-й - в 5,8 раза, по сравнению со здоровыми свиноматками.
Наши исследования показали, что при остром эндометрите отмечается достоверное снижение активности ЩФ во всех участках рогов матки и в маточной слизи. При этом активность ЩФ составляла в 1-й трети рогов матки 2,5±0,1, во 2-й трети 3,04±0,04 и в 3-й трети 2,3±0,1 ммоль/мг белка/мин, что соответственно в 4,5, 3 и 4 раза ниже аналогичных показателей у здоровых животных. В данном случае снижение активности ЩФ вероятно связано с нарушением трансмембранного переноса глюкозы и других сахаров в результате резкого уменьшения энергетического обмена и активности транспортных систем при развитии острого воспаления.
Активность АЛТ в эндометрии и маточной слизи при остром эндометрите достоверно увеличивалась по сравнению со здоровыми животными. Отмечено, что в 1-й трети она была выше в 1,6 раза, во 2-й трети в-1,4 раза и в 3-й трети в-1,6 раза. Активность АЛТ в маточной слизи больных эндометритом животных также была более высокой и превышала этот показатель в 2,1 раза по сравнению со здоровыми свиноматками. Такое увеличение активности АЛТ, по-видимому, связано с механизмами обезвреживания аммиака, образующегося в очаге воспаления при острой гипоксии и усиленном распаде аминокислот.
Полученные данные при исследовании АСТ свидетельствуют, что достоверных отличий между показателями активности этого фермента при остром эндометрите и у здоровых животных в 1-й трети рогов матки выявлено не было. Однако во 2-й и 3-й третях рогов матки у больных свиноматок наблюдалось снижение его активности. В маточной слизи при воспалительном процессе повышение активности АСТ было незначительным и составляло (4,7±0,2 ммоль/мг белка/мин).
Таким образом, проведенный комплекс исследований показал существенную роль внутриклеточных ферментных систем слизистой оболочки матки как у здоровых животных, так и у больным острым послеродовым эндометритом.
Установленные закономерности изменения активности ферментов в эндометрии в зависимости от стадии полового цикла и развития острого воспалительного процесса могут быть использованы для разработки способов коррекции патологических состояний с использованием различных химических и биологических препаратов, оказывающих модулирующее влияние на активность ферментов, а также в виде биохимических тестов, позволяющих оценивать уровень активности ферментов в тканях слизистой оболочки.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Варфоломеев С.Д. и др. //Биокенетика. -М. 1999 -С.716.
- Геккелер К. и др. Аналитические и препаративные лабораторные методы. - М.: Мир, 1994. С.416.
- Деффель К. Статистика и аналитическая химия. - М.: Мир, 1994. С.286.
- Досон Р. и др. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. - С. 464.
- Колб В.Г. и др. //Здравоохранение Белоруссии. - 1976.№ 9. С. 62.
- Крутов В.И. и др. Основы научных исследований.
- Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. - М.: Медицина, 1987. -С. 209.
- Серов и др. Воспаление. - М.: Медицина,1995. - С. 30.
- Тиц Н.У. Клиническая оценка лабораторных тестов. - М.: Медицина, 1986. - С. 207.
- Усольцева В.А. Ферменты и их клиническое значение. - Иваново, 1969. - С.35.
- Шехтер А.Б. Современные проблемы регенерации. - Йошкар - Ола, 1987. - С. 48.
- Anson M.L.J. //Gen. Phisiol. 1938. V.22 P.79.